黃芪苷Ⅳ防治大鼠腦皮層缺血-再灌注損傷的作用和對APE-Ref-1表達(dá)的研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、缺血性腦血管病(Ischemiccerebralvasculardisease,ICVD)是導(dǎo)致人類嚴(yán)重、長期能力喪失的主要原因。雖然溶栓治療是最有效的治療方法,但由于并發(fā)的缺血-再灌注損傷使該治療不能達(dá)到預(yù)期效果。為了減少腦缺血-再灌注損傷,必須充分了解神經(jīng)細(xì)胞損傷和修復(fù)的機(jī)制以能開發(fā)設(shè)計(jì)出有效的臨床治療方法及藥物的可能作用靶點(diǎn)。有很多的證據(jù)顯示自由基是導(dǎo)致腦缺血-再灌注后組織損傷的重要介質(zhì),因此清除自由基的藥物非常適用于治療腦缺血-

2、再灌注損傷。黃芪苷Ⅳ(AstragalosideⅣ,AST)是傳統(tǒng)中藥黃芪的主要活性成分,體外研究中發(fā)現(xiàn)它能清除氧自由基,有望開發(fā)成治療腦缺血-再灌注損傷的藥物。AST對大鼠腦缺血-再灌注后海馬的神經(jīng)保護(hù)作用已在我室的前期實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí),AST對腦缺血-再灌注后皮質(zhì)的作用及機(jī)制是本課題的研究方向。 在課題的第一部分中,32只健康大鼠被隨機(jī)分為4個實(shí)驗(yàn)組:缺血-再灌注模型組(M組)(n=10),低劑量治療組(AST1)(n=10)

3、,高劑量治療組(AST2)(n=10),假手術(shù)組(Sham)(n=2)。低、高劑量治療組大鼠在缺血前30min腹腔注射AST1mg/kg、4mg/kg,模型組大鼠缺血缺血前30min腹腔注射與治療藥物等劑量的生理鹽水,假手術(shù)組大鼠不誘發(fā)缺血-再灌注損傷。在課題的第二部分,32只健康大鼠被隨機(jī)分為上述4個實(shí)驗(yàn)組(每組n=8)。所有接受手術(shù)的鼠均采用線栓法制備局灶性大腦中動脈阻塞模型(Middlecerebralarteryocclusio

4、n,MCAO),尼龍絲線送至大腦中動脈造成局灶性缺血,絲線在血管中存留1h,而后拔除絲線引發(fā)再灌注。 第一部分實(shí)驗(yàn)檢測AST對腦缺血-再灌注損傷的保護(hù)作用,再灌注后6h處死大鼠前進(jìn)行神經(jīng)行為評分評價(jià)神經(jīng)功能,應(yīng)用TTC染色法檢測腦梗塞范圍,HE染色觀察病理變化。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),與模型組相比,AST1或AST2組可明顯改善大鼠的神經(jīng)缺損癥狀,AST1和AST2組可明顯降低神經(jīng)行為學(xué)評分(6.20±1.03、4.10±0.99vs7.80

5、±1.03,P<0.01)。AST在1mg/kg和4mg/kg劑量時(shí)可有效減少梗塞范圍(15.66±4.43%、7.77±2.55%vs20.77±4.56%,P<0.05)。AST1與AST2兩組比較在降低神經(jīng)行為評分和梗塞范圍上亦具有顯著性差異,4mg/kgAST比1mg/kgAST更有效。模型組大鼠再灌注6h后腦皮質(zhì)HE染色可見梗塞灶,中間有炎性細(xì)胞浸潤,并有缺血性變性細(xì)胞,在AST低劑量治療組可見噬神經(jīng)細(xì)胞及變性細(xì)胞,但無明顯梗

6、塞灶,AST高劑量治療組無明顯變性及壞死細(xì)胞。 第二部分實(shí)驗(yàn)探討AST抗腦缺血-再灌注損傷機(jī)制是否與其抗氧化特性有關(guān),檢測指標(biāo)為脂質(zhì)過氧化標(biāo)志物丙二醛(Malondialdehyde,MDA)的含量和抗氧化酶超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase,SOD)的活力。模型組大鼠缺血-再灌注后大腦皮質(zhì)組織中MDA比假手術(shù)組大鼠明顯升高(6.11±0.60vs4.71±0.65nmol/mgprot,P<0.01),1m

7、g/kg和4mg/kgAST治療組大鼠MDA含量的升高明顯減弱(5.44±0.58vs6.11±0.60nmol/mgprot,P<0.05;4.98±0.76%vs6.11±0.60nmol/mgprot,P<0.01)。與此抗氧化作用一致,AST在1mg/kg和4mg/kg的劑量時(shí)可以減弱SOD活力的降低。模型組大鼠缺血-再灌注后皮質(zhì)SOD活力比假手術(shù)組大鼠明顯降低(42.76±5.45vs62.08±8.59U/mgprot,P<

8、0.01),而在AST1和AST2組,SOD活力顯著升高(51.09±7.43vs42.76±5.45U/mgprot,P<0.05;56.11±7.02vs42.76±5.45U/mgprot,P<0.01),AST1和AST2組之間無差異。 為探索AST在治療腦缺血-再灌注損傷中的可能藥物作用靶點(diǎn),第三和第四部分實(shí)驗(yàn)應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法和Westernblot檢測無嘌呤/無嘧啶核酸內(nèi)切酶/氧化還原因子1(Apurinic/a

9、pyrimidinicendonuclease/redox-factor1,APE/Ref-1)在缺血-再灌注后大腦皮質(zhì)組織中的表達(dá)。APE/Ref-1是一種體內(nèi)分布廣泛的多功能蛋白質(zhì),通過修復(fù)DNA的無嘌呤/無嘧啶(apurinic/apyrimidinic,AP)部位參與DNA的堿基切除修復(fù)(Baseexcisionrepair,BER)。APE/Ref-1還可通過還原許多轉(zhuǎn)錄因子的半胱氨酸殘基使之易于與DNA結(jié)合而調(diào)控真核細(xì)胞的基

10、因表達(dá)。APE/Ref-1在腦缺血-再灌注損傷中發(fā)揮著重要的作用,它是AST的可能作用靶點(diǎn)。 免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)顯示假手術(shù)組大鼠APE/Ref-1在細(xì)胞核和細(xì)胞漿均有表達(dá),模型組大鼠再灌注后大腦皮質(zhì)組織中APE/Ref-1的表達(dá)明顯減少,且APE/Ref-1主要在細(xì)胞漿表達(dá),給予兩種劑量的AST治療后可明顯減弱APE/Ref-1表達(dá)的下降,APE/Ref-1的表達(dá)接近于假手術(shù)組大鼠,且在細(xì)胞核與細(xì)胞漿均有表達(dá)。Westernblo

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