結(jié)核分枝桿菌潛伏感染者和初發(fā)結(jié)核病患者免疫分子標(biāo)識的篩選.pdf

1、WHO報道目前全球已有1/3的人口感染了可導(dǎo)致結(jié)核病(tuberculosis，TB)的病原菌-結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，M.tb)。M.tb感染人體后一般會引起三種免疫結(jié)果：大約5％的感染者可在體內(nèi)完全清除細菌、5～10%的感染者發(fā)展成臨床結(jié)核病患者、90%感染者可長期攜帶病原菌成為潛伏感染者。所以結(jié)核分枝桿菌引起的感染人群是一個復(fù)雜群體。在結(jié)核分枝桿菌與宿主的相互作用中，細胞免疫應(yīng)答的結(jié)果直

2、接影響到疾病的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸。因此，本論文重點研究和篩選與宿主細胞免疫功能密切相關(guān)的基因，力爭為最終篩選一組除了IFN-γ以外的、可以體現(xiàn)機體不同感染狀態(tài)和不同病情的免疫標(biāo)識提供基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。
　　 論文第一部分結(jié)核分枝桿菌潛伏感染者和初發(fā)結(jié)核病患者免疫分子標(biāo)識的篩選和驗證
　　 因為潛伏感染人群是一個復(fù)雜的人群，因此本論文在臨床樣本分組方面結(jié)合結(jié)核菌素實驗(TST)和體外M.tb抗原特異性的IFN-γ釋放水平實驗(E

3、LISPOT)將結(jié)核分枝桿菌潛伏感染者細化為低IFN-γ釋放水平的潛伏感染者1組(LTB1)和高IFN-γ釋放水平的潛伏感染者2組(LTB2)。其次，選擇化療前的初發(fā)結(jié)核病患者作為病人組(TB)。CD4+T細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)在結(jié)核病發(fā)生、發(fā)展中的重要作用勿庸置疑，因此，本部分重點通過研究四組人群（HD、LTB1、LTB2和TB）外周血CD4+T細胞全基因組表達譜。通過生物信息學(xué)分析，我們在本論文中選擇對TNFSFs/TNFRSFs超家族

4、成員在四組不同人群中的表達情況進行了系統(tǒng)而全面的研究。熒光定量PCR和ELISA等驗證實驗結(jié)果表明：
　　 1．對人類外周血CD4+T細胞全基因組表達譜進行分析結(jié)果顯示：低IFN-γ釋放水平的潛伏感染組1人群( LTB1)外周血CD4+T細胞全基因組表達譜與同樣為潛伏感染者但是高表達IFN-γ的潛伏感染組2(LTB2)相差較遠；而低IFN-γ釋放水平的潛伏感染者(LTB1)全基因組表達譜更接近于TST陰性的健康對照。
　　

5、 2．TNFSFs/TNFRSFs超家族成員TNFSF13(APRIL)、TNFSF13B(BAFF)的結(jié)果顯示BAFF/APRIL通路可能參與結(jié)核病發(fā)生的免疫機制，兩者RNA和蛋白表達水平在結(jié)核病患者CD4+T細胞內(nèi)均顯著升高。而且，二者游離的蛋白水平在結(jié)核性胸膜炎患者胸水尤其升高。因此，TNFSF13(APRIL)、TNFSF13B(BAFF)可能具有預(yù)測和評估結(jié)核病病情發(fā)展的價值。
　　 論文第二部分結(jié)核分枝桿菌潛伏感染

6、者和初發(fā)結(jié)核病患者T細胞分化相關(guān)基因的初步研究以及體液中免疫因子的高通量檢測
　　 CD4+T細胞是復(fù)雜的，在同一時間可以存在不同發(fā)育階段或功能的亞群，行使不同的功能。因此在論文第二部分，我們同樣利用熒光定量PCR方法檢測了與T細胞分化及其功能相關(guān)的基因，希望能夠初步了解其相關(guān)基因是否與結(jié)核病的發(fā)生有關(guān)。初步結(jié)果表明：結(jié)核病的發(fā)生發(fā)展不僅僅只與Th1和Th2的分化相關(guān)，如其他文獻所示，Th17、調(diào)節(jié)性T細胞等細胞亞群同樣可能發(fā)揮

7、重要作用。而且，通過細胞內(nèi)基因表達水平比較也看出：
　　 1．Th17相關(guān)基因，RORc在LTB1和TB組明顯下調(diào)。Th17的形成需要IL-6R受體信號，IL6ST/gp130基因表達的蛋白是IL-6R信號通路上的一個分子，我們的驗證結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，IL6ST/gp130在LTB1組表達明顯下調(diào)。
　　 2．FOXP3是調(diào)節(jié)性T細胞的標(biāo)識分子之一、FOXP3在LTB2和TB組明顯下調(diào)；S1PR1對調(diào)節(jié)性T細胞的生成有抑制作用

8、，我們發(fā)現(xiàn)SIPR1在LTB1、LTB2和TB中都明顯下調(diào)。
　　 同時，我們也利用高通量的液態(tài)芯片技術(shù)，檢測不同感染狀態(tài)（潛伏患者1組和2組）和不同病情（初發(fā)結(jié)核病人和結(jié)核性胸膜炎）患者外周血和胸水中常見的23個細胞因子和趨化因子，尋找易于檢測的、具有預(yù)測和評估疾病發(fā)生、發(fā)展價值的免疫分子。通過比較初發(fā)結(jié)核病患者外周血和結(jié)核性胸膜炎患者胸水中的所檢測因子的表達水平，我們發(fā)現(xiàn)了以下結(jié)果：
　　 1．包括IFN-γ、IL-

9、1Rα、IL-6、G-CSF等炎性因子和趨化因子均在結(jié)核性胸膜炎患者胸水中顯著性高表達。
　　 2．因為文獻報道也證明IFN-γ、G-CSF等因子可以刺激多種細胞產(chǎn)生TNFSF13(APRIL)和TNFSF13B(BAFF)，為本論文第一部分結(jié)果中BAFF/APRIL在結(jié)核性胸膜炎患者胸水中高表達提供了可能的機制。
　　 綜上所述：本論文通過對不同感染狀態(tài)的潛伏期患者和初發(fā)結(jié)核病人T細胞功能基因的研究，首次提出TNFSF