骨髓干細胞在睪丸中橫向分化可能性的探索.pdf

1、睪丸是雄性個體最重要的生殖器官，它不僅是精子生成的重要場所，而且還具有分泌雄性激素、維持副性特征的功能。睪丸中主要有三種細胞——賴氏細胞、支持細胞、生殖細胞。賴氏細胞位于曲細精管之間，其分泌的睪酮等雄性激素維持著睪丸內(nèi)外的激素環(huán)境；支持細胞位于睪丸曲細精管內(nèi)基底膜附近，它們之間的緊密連接形成血睪屏障，將分化至各階段的生殖細胞包裹在其中，為精子發(fā)生提供免疫豁免環(huán)境。最近的研究證實在睪丸中支持細胞為精原干細胞提供了一種通用的存活及分化環(huán)境，

2、它不僅可以識別相同物種的精原干細胞，而且能識別不同物種的精原干細胞，并允許其回到曲細精管基底膜位置，重新啟動增殖、分化過程。然而，在精子發(fā)生過程中，究竟支持細胞提供的微環(huán)境起主導作用還是生殖細胞本身的分化特性起主導作用尚不清楚。 另外，近年來干細胞方面的研究主要集中于胚胎干細胞和成體干細胞。盡管胚胎干細胞因有“發(fā)育全能性”而極具應用潛力，但因涉及到倫理問題而備受爭議。而成體干細胞中的骨髓干細胞不存在倫理學方面的問題，獲取方便，同

3、時現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)骨髓干細胞具有可塑性，能橫向分化成多種組織器官細胞，如骨、軟骨、脂肪、肌肉、肝臟、腎、心臟，甚至腦的細胞。由此，我們提出問題：在睪丸中，外源骨髓干細胞能否與支持細胞相互識別并橫向分化為生殖細胞啟動精子發(fā)生過程?如果答案是肯定的說明在干細胞分化發(fā)育中微環(huán)境起著關(guān)鍵的作用，相反，說明生殖細胞本身更重要。 鑒于以上認識，本實驗從提取小鼠骨髓干細胞入手，分別采用睪丸網(wǎng)注射技術(shù)和尾靜脈注射技術(shù)將具有遺傳標記的供體骨髓干細胞移

4、植到去除了內(nèi)源性精原干細胞的野生型小鼠睪丸中，睪丸曲細精管為精子發(fā)生提供了一個特殊的微環(huán)境，同時也以供體精原干細胞對照進行相同的移植，觀察骨髓干細胞在睪丸這個免疫豁免的特殊環(huán)境中是否能夠增殖及分化。 結(jié)果顯示，對照組移植80天后，受體小鼠曲細精管內(nèi)供體精原干細胞大量增殖并重新啟動生精過程，生成了精子，且交配試驗獲得了正常的仔鼠。對照組移植的結(jié)果說明本實驗所使用的睪丸網(wǎng)細胞移植技術(shù)是成熟的。由于供體細胞在移植時是由睪丸網(wǎng)到達曲細精

5、管管腔中，而精子發(fā)生卻要首先從基底膜開始穿越支持細胞間形成的緊密連接再到達管腔，證明異體外源精原干細胞可以逆向穿越受體小鼠睪丸的血睪屏障，回到基底膜位置重新定位(歸巢)，并可以在支持細胞的營養(yǎng)調(diào)節(jié)下啟動增殖、分化，最終形成精子；亦證明了精原干細胞的移植確實能夠使受體小鼠恢復生育能力，為本研究提供了技術(shù)保障。 實驗組分兩種情況，一是將供體骨髓干細胞經(jīng)睪丸網(wǎng)移植到受體小鼠睪丸中，二是將供體骨髓干細胞經(jīng)尾靜脈移植到受體小鼠的血液中。睪

6、丸網(wǎng)移植結(jié)果顯示，移植后的受體小鼠睪丸恢復了生精過程，同時原位PCR技術(shù)進一步證明此睪丸中的生殖細胞來源于供體骨髓干細胞，說明外源骨髓干細胞在受體小鼠曲細精管中可以歸巢和增殖，即可以分化成為生殖細胞；經(jīng)尾靜脈注射的骨髓干細胞在受體小鼠睪丸中的分化結(jié)果顯示，移植后6M，常規(guī)檢測得知野生型受體小鼠曲細精管上皮仍然很薄(只有一層睪丸支持細胞)，在睪丸中未見任何供體來源的細胞，也沒有生殖細胞歸巢或增殖的跡象，說明供體骨髓干細胞不能夠經(jīng)過血液循環(huán)

7、到達睪丸管腔中。由上可知，將外源骨髓干細胞經(jīng)睪丸網(wǎng)移植到去除了內(nèi)源性精原干細胞受體小鼠睪丸后，它們可以逆向通過睪丸的血睪屏障到達曲細精管基底膜(歸巢)，橫向分化成為生殖細胞啟動精子發(fā)生過程，即支持細胞可以識別外源的骨髓干細胞，允許其歸巢，重新啟動增殖、分化過程。但經(jīng)尾靜脈注射的骨髓干細胞則無法到達睪丸的曲細精管內(nèi)。 本課題采用睪丸網(wǎng)注射技術(shù)和尾靜脈注射技術(shù)研究外源骨髓干細胞與睪丸內(nèi)微環(huán)境的相互關(guān)系及其橫向分化潛能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過血

8、液移植骨髓干細胞無法使其在受體睪丸中歸巢并增殖、分化，而通過睪丸網(wǎng)移植骨髓干細胞能夠使其在受體睪丸中歸巢并增殖、分化，說明在骨髓成體干細胞的分化過程中其微環(huán)境具有關(guān)鍵的作用，它可以誘導干細胞改變分化方向或進程即橫向分化。。本研究不僅為最終闡明睪丸內(nèi)細胞間的相互作用提供可靠的依據(jù)；而且對探討骨髓干細胞的橫向分化潛能具有重要的理論意義，同時為后續(xù)成體干細胞橫向分化技術(shù)的研究打下基礎，也為推動成體干細胞的臨床應用起到積極的作用，可為男性不育患