魔芋離體形態(tài)發(fā)生機制及其繁殖技術(shù).pdf

1、魔芋(Konjac)是植物界中迄今發(fā)現(xiàn)唯一能大量合成葡苷聚糖(Konjacglucomannan)的高等植物,屬天南星科(Araceae)魔芋屬(Amrophophallus Blume),為多年生草本植物,廣泛分布于我國西南山區(qū),具有悠久的栽培和利用歷史。魔芋葡甘聚糖是魔芋地下球莖主要貯藏物質(zhì),為一種高分子量碳水化合物,因具有良好的膠溶性、凝膠性、增稠性、成膜性及與其它植物膠的優(yōu)良復(fù)配性等優(yōu)點而在食品、化工、醫(yī)藥保健、環(huán)保等領(lǐng)域具有廣

2、泛的應(yīng)用。因此,魔芋具有極高的市場開發(fā)和利用價值。
　　 魔芋為單葉柄支撐的單葉植物,通常利用球莖著生的根狀莖進行無性繁殖,其繁殖系數(shù)極低,且多年沿用無性繁殖造成病原菌的積累、種性的退化,進而導(dǎo)致魔芋產(chǎn)量下降、品質(zhì)劣化。由于缺乏穩(wěn)定的良種繁育體系,種芋的數(shù)量和質(zhì)量已經(jīng)成為魔芋生產(chǎn)發(fā)展的瓶頸。自上個世紀80年代以來,許多研究者試圖利用組織培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)脫毒試管苗,以繁殖種芋,但試管苗因移栽成活率低且對田間管理技術(shù)要求較高,不能實現(xiàn)周

3、年供應(yīng)和長距離運輸?shù)热秉c,無法在實際生產(chǎn)中廣泛運用。二十世紀90年代以來,隨著對植物變態(tài)器官發(fā)育機理認識的不斷深入,人們在試管中已成功誘導(dǎo)出了塊莖、球莖、鱗莖等營養(yǎng)繁殖器官,其中馬鈴薯試管塊莖生產(chǎn)體系最為成熟,已經(jīng)實現(xiàn)了工廠化生產(chǎn),但有關(guān)魔芋試管球莖的研究國內(nèi)外尚未見報道。本研究以花魔芋(A.rivieri)和白魔芋(A.albus)為材料,對魔芋試管球莖的形成及魔芋組織培養(yǎng)繁殖方式開展了系列研究,主要結(jié)果如下:
　　 1.幼嫩

4、葉柄是魔芋組織培養(yǎng)較好的外植體,愈傷組織形成率高,狀態(tài)好。MS+1.0mg/L NAA+1.0mg/L BA適宜于愈傷組織誘導(dǎo),而MS+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L BA有利于愈傷組織增殖。愈傷組織在繼代培養(yǎng)過程中可形成3種不同的類型,即Ⅰ:水漬狀,半透明；Ⅱ:淡黃色,結(jié)構(gòu)疏松；Ⅲ:淺紅或綠色,呈瘤狀或球狀,結(jié)構(gòu)致密。在分化培養(yǎng)基上,Ⅰ型愈傷組織不能分化出芽,Ⅱ型可分化出不定芽,而Ⅲ型可通過擬球莖再生完整植株。這三種類型愈

5、傷組織在特定的培養(yǎng)條件下可相互轉(zhuǎn)化。組織學(xué)觀察顯示,三種類型的愈傷組織其組成細胞類型明顯不同,其中Ⅲ型愈傷組織由保守分裂型細胞組成,其細胞中含有淀粉和葡甘聚糖顆粒,是一種半組織化結(jié)構(gòu)。中等濃度(1.0～2.0mg/L)的細胞分裂素(BA、KT、ZT和TDZ)與低濃度(0.1～1.0mg/L)的NAA配合均能促使Ⅲ型愈傷組織再生植株。
　　 2.魔芋離體形態(tài)建成以器官發(fā)生途徑為主,擬球莖和芽發(fā)生是主要形式。組織學(xué)觀察顯示,魔芋葉柄

6、無維管組織形成層,維管束外層薄壁在培養(yǎng)過程首先啟動脫分化,進而形成愈傷組織。魔芋形態(tài)建成以器官發(fā)生途徑為主,在特定培養(yǎng)條件下也可形成體細胞胚,但頻率極低,且絕大部分體胚因高度畸形化而不能形成再生植株。魔芋可通過不定芽器官發(fā)生途徑或擬球莖器官發(fā)生途徑形成植株,通過擬球莖形成的植株不需生根培養(yǎng)就具有完整的根系,而不定芽在發(fā)育過程中不能直接生根且植株生長勢弱。不定芽和擬球莖均起源于Ⅲ型愈傷組織的次表皮細胞,這類細胞在分化過程中首先形成擬分生組

7、織團。擬分生組織團在分化培養(yǎng)中既可直接形成芽原基,進而發(fā)生不定芽,可形成一種中間的球狀體,這種球狀體具頂芽分生組織,葉原基不明顯,它可進一步發(fā)育成擬球莖,進而形成完整植株。
　　 3.內(nèi)源GA3含量增加伴隨著不定芽發(fā)生,而JA含量增加伴隨著擬球莖發(fā)生,內(nèi)源激素平衡是器官發(fā)生方式的關(guān)鍵調(diào)空因素。魔芋葉柄薄壁細胞在脫分化形成愈傷組織過程中,其內(nèi)源激素(IAA、GA3、ABA和JA)含量發(fā)生了明顯的變化。內(nèi)源IAA含量培養(yǎng)初期緩慢下降

8、,10d后快速上升,30d后達到平穩(wěn)。內(nèi)源ABA含量在培養(yǎng)20d內(nèi)呈下降趨勢,之后迅速上升。內(nèi)源GA3和JA含量則在整個愈傷組織誘導(dǎo)過程中迅速下降。研究發(fā)現(xiàn),三種內(nèi)源激素(GA3、ABA和JA)在形成芽和擬球莖的愈傷組織中含量變化明顯不同。內(nèi)源GA3水平在擬球莖發(fā)生過程中變動不大,而在不定芽發(fā)生過程中快速上升,其絕對含量也比前者高:內(nèi)源ABA在擬球莖發(fā)生過程中基本維持穩(wěn)定,而在不定芽發(fā)生過程中則迅速下降；內(nèi)源JA含量在擬球莖形成過程中呈

9、明顯上升趨勢,而在不定芽發(fā)生過程中變化不明顯。只有內(nèi)源IAA無論是擬球莖還是不定芽形成過程其含量均呈下降趨勢。內(nèi)源GA3與ABA和JA的平衡水平在兩種不同器官發(fā)生途徑中呈現(xiàn)出明顯的差異,但GA3/JA差異最為顯著,在兩種器官發(fā)生途徑中其變化趨勢完全相反。上述結(jié)果說明,魔芋離體器官發(fā)生形式與內(nèi)源激素變化及平衡水平相關(guān)。
　　 4.魔芋試管球莖(即擬球莖)的形成受培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的影響。中等濃度的BA(1.0～2.0mg/L)與低濃

10、度的NAA(0.1～0.5mg/L)配合有利于Ⅲ型愈傷組織形成試管球莖,其中以MS+2.0mg/L BA+0.5 mg/L NAA表現(xiàn)最佳。在一定范圍內(nèi)提高培養(yǎng)基中蔗糖濃度有利于白魔芋試管球莖形成,其中6％(w/v)蔗糖效果最好。而花魔芋試管球莖形成所要求的蔗糖濃度較低(4％)。光周期對試管球莖的發(fā)生影響不明顯,而培養(yǎng)溫度的影響則較大,22℃條件下,花魔芋和白魔芋試管球莖形成率、形成個數(shù)和單球莖鮮重均達最大值。試管球莖在培養(yǎng)過程可產(chǎn)生次

11、級小球莖以進行增殖,但自然增殖率較低,通過損傷主芽方法打破主芽頂端優(yōu)勢,可促使次級小球莖的發(fā)生。
　　 5.選擇性培養(yǎng)魔芋愈傷組織有助于降低再生植株遺傳變異頻率。對魔芋Ⅲ型愈傷組織進行選擇并于適宜培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng),棄除狀態(tài)發(fā)生改變的愈傷組織類型,獲得不同培養(yǎng)時期的4個再生植株群體G0(初代培養(yǎng)產(chǎn)生)、G2(繼代3次產(chǎn)生)、G4(繼代5次產(chǎn)生)和G7(繼代8次產(chǎn)生)。經(jīng)兩種分子標記技術(shù)(RAPD和ISSR)分析顯示,G0群體變異頻

12、率最高(RAPD:15.6％:ISSR:18.0％),G2、G4和G7的變異頻率依次下降。四個群體中,G0再生植株的RAPD差異位點數(shù)最多,而其它三個群體的植株差異位點數(shù)較少。ISSR技術(shù)檢測的差異位點數(shù)比RAPD技術(shù)檢測到的要高,但在四個群體中分布差異不明顯。上述結(jié)果表明,通過對Ⅲ型愈傷組織選擇性培養(yǎng)不會導(dǎo)致變異頻率增加,魔芋組織培養(yǎng)中的不穩(wěn)定性主要發(fā)生于基因組中重復(fù)區(qū)域,造成植株性狀改變的可能性較小。
　　 6.試管球莖是建