移植肝冷保存-再灌注中肝細(xì)胞線粒體DNA ATPase6、ATPase8基因表達(dá)和功能改變的研究.pdf

1、目的： 一、研究冷保存-再灌注肝移植大鼠肝細(xì)胞線粒體DNAATPase6、ATPase8基因表達(dá)變化以及對其編碼的F0F1-ATPase表達(dá)和功能的影響，從轉(zhuǎn)錄、翻譯水平探討冷保存-再灌注后ATPase6、ATPase8基因在線粒體有氧呼吸功能改變中的作用，揭示冷保存-再灌注損害中能量代謝障礙的分子機(jī)制。 二、研究線粒體DNA上游調(diào)節(jié)基因NFR-1和mtTFA對冷保存肝移植大鼠肝細(xì)胞線粒體DNAATPase6、ATPas

2、e8基因表達(dá)的影響，探討NFR-1和mtTFA對冷保存肝移植大鼠肝細(xì)胞線粒體DNA調(diào)節(jié)作用及其機(jī)理。 方法： 1.Wistar大鼠186只，采用改良“二袖套法”制作大鼠肝移植模型，動物隨機(jī)分為A組(冷保存30min組)，B組(冷保存6h組)，C組(冷保存12h組)和D組(假手術(shù)對照組)，分別于制模后于12h、24h、3d、5d、7d采集標(biāo)本，保證每時相點存活大鼠6只。 2.觀察各組大鼠肝臟的病理改變、肝功能、肝組

3、織SOD、ATPase、ATP含量及線粒體形態(tài)。 3.采用RT-PCR方法檢測mtDNAATPase6、ATPase8mRNA和NFR-1和mtTFAmRNA的表達(dá)變化。采用Western-blot法檢測肝細(xì)胞線粒體F0F1-ATPase蛋白的表達(dá)變化。 結(jié)果： 1.各組手術(shù)時間及無肝期基本接近，無統(tǒng)計學(xué)差異，肝臟復(fù)流后全肝灌注均勻，動物并發(fā)癥較少。冷保存30min、6h、12h三個時相點肝移植大鼠的損傷程度存在

4、明顯差異。 2.C組再灌注后肝臟病理變化、肝功能損害、肝組織SOD、ATPase、ATP含量降低較A組、B組顯著(P＜0.05)。再灌注7d后B組、C組肝功能趨于正常，但C組肝組織SOD、ATPase、ATP含量仍增高。 3.冷保存再灌注后早期(12h)，A、B、C三組ATPase6、ATPase8mRNA表達(dá)均降低，C組顯著低于A組、B組(P＜0.05)，并且ATPase6、ATPase8mRNA量的變化趨勢一致，F(xiàn)0

5、F1-ATPase表達(dá)量也降低(P＜0.05)，再灌注24h后A組、B組、C組ATPase6、ATPase8mRNA表達(dá)開始升高，F(xiàn)0F1-ATPase表達(dá)量也增加，C組ATPase6、ATPase8mRNA表達(dá)以及：F0F1-ATPase表達(dá)量的升高較A組、B組緩慢。 4.冷保存再灌注后早期(12h)，A、B、C三組mtTFA及NRF-1mRNA表達(dá)降低，以C組最為顯著(P＜0.05，與A組、B組相比)，24h后各組mtTFA

6、及NRF-1mRNA表達(dá)開始升高，ATPase6、ATPase8mRNA表達(dá)也升高，并且升高趨勢與mtTFA及NRF-1mRNA表達(dá)增高基本一致。 結(jié)論： 1.本動物模型縮短了肝移植大鼠的手術(shù)無肝期，提高了大鼠肝移植的成功率和存活率，具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。并且冷保存30min、6h、12h三個時相點肝移植大鼠存活率及不同損傷程度可滿足研究冷保存再灌注損傷及修復(fù)的要求。 2.供肝冷保存-再灌注對肝細(xì)胞及其線粒體

7、有明顯的損害作用，表現(xiàn)為血清ALT、AST升高，肝組織ATPase、SOD降低、ATP生成減少，肝細(xì)胞凋亡明顯，并隨冷保存時間的延長而進(jìn)一步加重。再灌注后，隨著時間的延長SOD含量逐步升高，肝細(xì)胞及其線粒體病理損害逐漸減輕，ATP合成逐漸增加。提示在冷保存-再灌注過程中，肝細(xì)胞及其線粒體的損傷可能與氧自由基活動的增加有關(guān)。 3.供肝在冷保存-再灌注后肝細(xì)胞ATPase6、ATPase8mRNA表達(dá)異常，細(xì)胞能量供應(yīng)急劇下降，并且

8、與ATPase6、ATPase8mRNA表達(dá)異常密切相關(guān)，表明線粒體功能障礙可能與線粒體編碼ATPase6、ATPase8基因之間存在聯(lián)系。 4.冷保存-再灌注后ATPase6、ATPase8基因表達(dá)及其編碼的線粒體呼吸鏈蛋白F0F1-ATPase蛋白表達(dá)量減少，并且冷保存時間的延長，再灌注后變化越顯著，對ATP能量合成影響越大。同時ATPase6、ATPase8mRNA量的變化趨勢基本一致，提示ATPase6、ATPase8基