早發(fā)冠心病臨床特點及相關(guān)基因和血清學(xué)指標的研究.pdf

1、目的： 1、研究分析早發(fā)冠心病患者的傳統(tǒng)危險因素、脂類代謝情況、冠狀動脈病變特點。 2、研究散發(fā)早發(fā)冠心病患者中MEF2A Exon 7和Exon 11以及ACE 16Intron基因突變情況。 3、進一步研究不同早發(fā)冠心病家系遺傳特點，進而明確MEF2A和ACE基因突變與早發(fā)CAD的相關(guān)性。 4、研究早發(fā)冠心病患者中eNOS和ET-1水平的改變，進而明確內(nèi)皮功能異常與早發(fā)CAD發(fā)病之間的聯(lián)系。

2、5、研究不同相關(guān)脂蛋白對內(nèi)皮細胞MEF2A表達水平的影響。 6、構(gòu)建MEF2A真核表達載體，并明確該表達載體在細胞中能進行相應(yīng)蛋白表達。 方法： 1、收集臨床資料，血管造影結(jié)果，對早發(fā)冠心病患者、非早發(fā)冠心病患者和非冠心病患者的傳統(tǒng)危險因素、脂類代謝情況、冠狀動脈病變特點進行統(tǒng)計分析。 2、在基因水平，采用片斷長度多態(tài)性和直接測序的方法對所有研究對象(包括家系及散發(fā)病例)ACE 16Intron和MEF2

3、A Exon 7和Exon 11的突變情況進行分析。 3、在蛋白水平，采用ELISA方法對所有研究對象外周血中eNOS水平和ET-1水平進行檢測。 4、在mRNA水平，采用實時熒光定量反轉(zhuǎn)錄PCR方法研究不同濃度LDL、HDL對內(nèi)皮細胞MEF2A表達水平的影響。 5、在細胞水平，采用質(zhì)粒構(gòu)建、真核細胞轉(zhuǎn)染的方法明確特定MEF2A片斷在真核細胞中表達狀況。 結(jié)果： 1、早發(fā)CAD臨床特點：①傳統(tǒng)危險

4、因素顯著少于非早發(fā)CAD；②吸煙和陽性家族史比率顯著高，高血壓比率顯著低；③TG水平顯著高；④以急性冠脈綜合癥起病為主，并且以單支血管受累為主；⑤病例平均病變積分較低，輕度病變比率較高。有統(tǒng)計學(xué)意義。 2、以非早發(fā)CAD病例為參照，對早發(fā)CAlD進行冠心病傳統(tǒng)危險因素Logistic回歸發(fā)現(xiàn)早發(fā)CAD病例中陽性家族史對導(dǎo)致疾病起顯著作用，吸煙起很重要的作用。 3、成功收集早發(fā)冠心病大家系2個，小家系3個。 4、在

5、我國漢族人群中，MEF2A Exon 7基因變異與早發(fā)CAD沒有相關(guān)性。 5、MEF2A Exon 11上發(fā)現(xiàn)有5個多態(tài)性位點：①1258～1290(cAG)n(n=4～11)，其CAG重復(fù)數(shù)的改變對早發(fā)CAD的發(fā)生可能沒有作用；②1291～1293CCG/-，其DD/DW基因型和D等位基因與CAD尤其是早發(fā)CAD的發(fā)生有關(guān)；③1303C/T為新發(fā)現(xiàn)的位點，在既往研究中從未報道；④1305G/A，其多態(tài)性與早發(fā)CAD沒有相關(guān)性；

6、⑤1353G/T，其TT基因型和T等位基因?qū)υ绨l(fā)CAD和CAD的發(fā)生有關(guān)。MEF2A Exon 11的1291～1293CCG/-，1305G/A和1353G/T三個位點各組間的分布均存在連鎖不平衡或強不平衡。1291～1293 CCG D+1305 G+1353T單倍型對早發(fā)CAD的發(fā)生明顯相關(guān)。 6、ACE 16Intron I/D多態(tài)位點的DD基因型和D等位基因與CAD的發(fā)生有關(guān)，但其與早發(fā)CAD的關(guān)系有待進一步擴大樣本量

7、證實。 7、在PCADLG01家系中，MEF2A Exon 11的1291～1293CCG/-DW雜合突變型和1353 G/T的TT純合突變很有可能是導(dǎo)致其眾多家系成員發(fā)生早發(fā)CAD的病因。然而MEF2A Exon 11和ACE 16Intron的突變在另外幾個家系中沒有明顯相關(guān)性。 8、eNOS水平：①早發(fā)CAD組<非早發(fā)組<正常對照組，有顯著差異；②其與病變嚴重程度和病變血管支數(shù)呈負相關(guān)，但是未達到統(tǒng)計學(xué)顯著意義；③

8、與吸煙狀態(tài)呈顯著負相關(guān)；④去除吸煙的混雜因素后，eNOS水平在三組間仍然有顯著差異(早發(fā)CAD組<非早發(fā)組<正常對照組)。 9、ET-1水平：①早發(fā)CAD組>非早發(fā)CAD組和正常對照組，有顯著差異；②非早發(fā)組>正常對照組，但未能達到統(tǒng)計學(xué)顯著差異；③其與病變嚴重程度和病變血管支數(shù)呈正相關(guān)，但未達到統(tǒng)計學(xué)顯著意義。 10、eNOS水平和ET-1水平的關(guān)系：呈負相關(guān)性，有統(tǒng)計學(xué)意義。 11、體外細胞學(xué)實驗，用熒光定量

9、RT-PCR檢測MEF2A表達水平：①證實熒光定量RT-PCR是一種新的更為靈敏、高效的研究手段來探討危險因素對心血管系統(tǒng)相關(guān)基因表達的影響；②人臍靜脈內(nèi)皮細胞中MEF2A的表達顯著高于外周血細胞；③LDL刺激能顯著降低人臍靜脈內(nèi)皮細胞MEF2A基因的表達水平，HDL作用與其相反。作用內(nèi)皮細胞6 h和12 h此效果不顯著，24 h后明顯，該作用呈明顯的劑量依賴性。 12、成功構(gòu)建的MEF2A真核表達載體在內(nèi)皮細胞等細胞中均可以表

10、達。 結(jié)論： 1、本實驗從臨床水平觀察到：較非早發(fā)CAD，早發(fā)CAD的傳統(tǒng)危險因素較少，吸煙、冠心病陽性家族史和TG水平升高可能在其發(fā)生過程中起了很重要的作用。早發(fā)CAD往往發(fā)病較急，側(cè)支循環(huán)來不及建立，預(yù)后較差。 2、本實驗從基因水平發(fā)現(xiàn)：國外已報道的MEF2A Exon 7多態(tài)性位點與在我國漢族人群早發(fā)CAD的發(fā)生無明顯相關(guān)；但MEF2A Exon 11多個多態(tài)性位點與早發(fā)CAD的發(fā)生明顯相關(guān)；ACE 16I

11、ntron的多態(tài)性與CAD的發(fā)生明顯相關(guān)，但是與早發(fā)CAD的關(guān)系有待進一步擴大樣本量證實。早發(fā)CAD在不同人群，不同家系中具有遺傳異質(zhì)性。 3、本實驗從血清學(xué)水平觀察到：早發(fā)CAD組eNOS較低，ET-1水平較高，內(nèi)皮功能失調(diào)很可能是引起早發(fā)CAD的病理基礎(chǔ)。 4、LDL、HDL除了在脂質(zhì)代謝中起作用外，還可能會影響MEF2A基因的表達。 5、可以將MEF2A載入到真核表達載體，并在內(nèi)皮細胞中表達，將來完全可以以