TIMP-1過表達(dá)對糖尿病胰腺β細(xì)胞損傷保護(hù)作用的機制研究.pdf

1、背景與目的：金屬蛋白酶組織抑制劑-1(tissueinhibitorofmetalloproteinase-1，TIMP-1)是基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑家族的主要成員，是一種多功能蛋白，參與多種病理和生理過程。TIMP-1除抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinase，MMP)的活性外，尚具有促進(jìn)細(xì)胞增殖/抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)類固醇激素合成、抗血管生成等功能。最近研究表明，TIMP-1在體外能抑制IL-1β，TNF-α，

2、IFN-γ等細(xì)胞因子介導(dǎo)的胰腺β細(xì)胞凋亡，而β細(xì)胞凋亡在糖尿病的發(fā)病機制中起著至關(guān)重要的作用。據(jù)此，我們假設(shè)，TIMP-1可能通過抑制胰腺β細(xì)胞凋亡而延遲鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)誘導(dǎo)的糖尿病發(fā)生。但目前尚無在動物整體水平研究TIMP-1對胰腺β細(xì)胞損傷保護(hù)作用的報道。故本研究擬建立人TIMP-1(humanTIMP-1，hTIMP-1)轉(zhuǎn)基因純系小鼠，并利用該動物模型，探討TIMP-1對STZ誘導(dǎo)的胰腺β細(xì)胞損

3、傷可能存在的保護(hù)作用及其機制。 方法：(1)利用本室前期采用受精卵原核顯微注射技術(shù)獲得的hTIMP-1轉(zhuǎn)基因首建鼠進(jìn)行傳代，采用傳代鑒定和熒光原位雜交(fluorescenceinsituhybridization，F(xiàn)ISH)技術(shù)相結(jié)合的方法篩選純合子，建立hTIMP-1轉(zhuǎn)基因純系小鼠；利用Southernblot及反向PCR相結(jié)合的方法，鑒定外源基因在轉(zhuǎn)基因小鼠基因組中的整合形式；利用Northernblot的方法研究外源基因

4、hTIMP-1在轉(zhuǎn)基因小鼠的組織表達(dá)譜。(2)利用獲得的hTIMP-1轉(zhuǎn)基因純系小鼠，觀察不同劑量STZ對其血糖及存活率的影響；TUNEL染色觀察STZ(100mg/kg)刺激后胰島細(xì)胞凋亡的時相變化，確定凋亡高峰；運用TUNEL和胰島素雙重染色觀察凋亡高峰時，轉(zhuǎn)基因模型組和正常模型組小鼠胰島β細(xì)胞凋亡的情況；運用RT-PCR及Westernblot檢測凋亡高峰時，凋亡相關(guān)因子Bcl-2、Bcl-XL、Bax的表達(dá)，以及caspase-

5、3、caspase-9的表達(dá)。 結(jié)果：(1)成功建立了hTIMP-1轉(zhuǎn)基因純系小鼠動物模型，并鑒定出外源基因hTIMP-1是以單拷貝、單位點形式完整整合在轉(zhuǎn)基因小鼠17號染色體E1.3區(qū)，同時證實外源基因hTIMP-1能在轉(zhuǎn)基因小鼠染色體上穩(wěn)定整合，并遺傳給后代；外源基因hTIMP-1在轉(zhuǎn)基因小鼠的腎臟、肝臟和胰腺特異性表達(dá)。(2)與正常模型組比較，hTIMP-1轉(zhuǎn)基因模型組小鼠能夠延遲不同劑量STZ誘導(dǎo)的血糖升高；確認(rèn)STZ(

6、100mg/kg)刺激后12小時為胰島細(xì)胞的凋亡高峰；凋亡高峰時與正常模型組比較，轉(zhuǎn)基因模型組小鼠胰島TUNEL及胰島素染色雙陽性的β細(xì)胞凋亡率明顯減少[(2.5±0.6)％vs(12.7±2.6)％，P=0.01]；凋亡高峰時，協(xié)方差分析凋亡相關(guān)因子mRNA及蛋白水平表達(dá)的結(jié)果表明：①胰腺組織Bcl-2、Bax表達(dá)水平，轉(zhuǎn)基因組與正常組比較無顯著性差異(P＞0.05)；STZ刺激后兩組均顯著上調(diào)，但其反應(yīng)趨勢兩組之間無顯著性差異(P＞

7、0.05)，提示Bcl-2、Bax的表達(dá)不受外源基因hTIMP-1的影響。②胰腺組織Bcl-XL表達(dá)水平，轉(zhuǎn)基因組高于正常組(P＜0.05)；STZ刺激后兩組均顯著上調(diào)，但其反應(yīng)趨勢兩組之間無顯著性差異(P＞0.05)，提示外源基因hTIMP-1可上調(diào)Bcl-XL的表達(dá)。③胰腺組織caspase-3、caspase-9表達(dá)水平，轉(zhuǎn)基因組與正常組比較無顯著性差異(P＞0.05)；STZ刺激后正常模型組的表達(dá)顯著上調(diào)，而轉(zhuǎn)基因模型組的表達(dá)輕

8、度上調(diào)，對STZ刺激的反應(yīng)趨勢兩組之間比較有顯著性差異(P＜0.05)，提示外源基因hTIMP-1可下調(diào)STZ刺激后caspase-3、caspase-9的表達(dá)。 結(jié)論：(1)成功建立了hTIMP-1轉(zhuǎn)基因純系小鼠模型；(2)在動物整體水平，外源基因hTIMP-1可上調(diào)凋亡抑制因子Bcl-XL的表達(dá)，下調(diào)STZ刺激后caspase-3、caspase-9的表達(dá)，從而抑制STZ誘導(dǎo)的胰腺β細(xì)胞凋亡，延遲hTIMP-1轉(zhuǎn)基因小鼠血糖