不同分子量和硫酸化程度肝素組分的抗阿爾茨海默病活性研究.pdf

1、肝素一直以來僅作為抗凝和抗血栓藥物用于臨床，作為一種糖胺聚糖，其結構特點是高分子和高負電密度;從已經闡明的抗凝活性看，其活性是分子量和硫酸基所依賴的。近年來，肝素的抗炎、抗補體激活等非抗凝活性也得到關注，但尚未得到應用。阿爾茨海默病(Alzheimer'sdisease，AD)，又稱早老性癡呆癥，是一種神經系統(tǒng)退行性疾病，對老年人的健康產生極大威脅。AD的特征性病理學改變?yōu)榇竽X皮質神經細胞內神經原纖維纏結、細胞外大量老年斑形成和大腦皮質

2、細胞減少。β-淀粉樣蛋白(β-amyloid，Aβ)沉積被認為是老年斑的主要成分，也是阿爾茨海默病的發(fā)病機制之一。Aβ的沉積被認為是由淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein，APP）的代謝異常導致的。寡聚化的Aβ和Aβ沉積物又會引發(fā)對腦組織的一系列損傷，最終導致AD病變。其中，神經炎癥，特別是對腦內補體系統(tǒng)的激活，是Aβ的重要損傷機制之一。已有研究發(fā)現(xiàn)，肝素對APP代謝相關酶有著重要作用，對AD引起的神經炎癥

3、也存在著重要影響，但缺乏系統(tǒng)和深入的研究。本課題利用Aβ?lián)p傷的神經元樣細胞作為細胞模型，研究不同分子量和硫酸化程度肝素組分對APP代謝和AD引發(fā)的補體激活的作用，以闡明肝素結構與其抗AD活性的關系。
　　本課題的研究內容及成果主要包括五個方面:
　　1.AD細胞模型的構建
　　通過RA誘導分化人神經母細胞瘤細胞SH-SY5Y構建神經元樣細胞模型。RA處理使SH-SY5Y的形態(tài)發(fā)生明顯變化，形成神經元細胞特有的軸突的結構

4、和細胞標記。利用MTT比色法測定Aβ1-42對神經元樣細胞的損傷。確定用濃度為100μg/mL的Aβ1-42處理神經元樣細胞24h可復制AD樣細胞模型。
　　2.不同分子量和硫酸化程度肝素組分對神經元樣細胞和AD樣細胞存活率的研究
　　利用MTT比色法測定了不同分子量和硫酸化程度的肝素組分對神經元樣細胞和AD樣細胞存活率的影響，包括肝素、依諾肝素、2-O-脫硫酸肝素、6-O-脫硫酸肝素、N-脫硫酸-乙酰化肝素、肝素二糖、肝素

5、四糖、肝素十糖和肝素十六糖。不同肝素組分對神經元樣細胞存活率沒有顯著性影響。而對于AD樣細胞，分子量在3000-5000Da，且含有O-硫酸基和N-硫酸基的肝素組分，如依諾肝素、肝素十六糖等，能顯著提高AD樣細胞的存活率、抑制Aβ對神經元樣細胞的損傷的活性在所有肝素組分中。
　　3.不同分子量和硫酸化程度肝素組分對APP代謝作用的研究
　　首次利用Aβ?lián)p傷的神經元樣細胞作為AD細胞模型，分析了Aβ1-42對神經元樣細胞的AP

6、P代謝關鍵酶、APP和生成的相關片段的影響，以及肝素及其衍生物對Aβ1-42引起的上述變化的影響。Aβ1-42顯著提高了BACE1的表達量，而肝素及其衍生物對其具有抑制作用，依諾肝素、肝素十糖和肝素十六糖對BACE-1生成的抑制作用最強。Aβ1-42提高了ADAM10前體及ADAM10表達量，但并不顯著。結果提示肝素的硫酸基，特別是6-O-硫酸基和N-硫酸基，分子量在十糖到十六糖長度的糖鏈對肝素抑制Aβ引起的APP代謝關鍵酶表達是必需的

7、。
　　Aβ1-42提高了AD樣細胞的APP表達量，降低了C99的表達量，而C83的表達量基本不變，但這些影響并不顯著。2-O-脫硫酸肝素和肝素二糖、四糖、十糖、十六糖使C83表達量明顯增加，提示肝素對ADAM10的酶活力可能存在著重要影響。
　　4.不同分子量和硫酸化程度肝素組分對補體系統(tǒng)作用的研究
　　免疫熒光檢查發(fā)現(xiàn)，Aβ1-42促進神經元樣細胞表達C5b-9，而且封閉CD59對表達量并無明顯影響。肝素能抑制Aβ

8、1-42引起的C5b-9表達。
　　首次利用Aβ1-42損傷的神經元樣細胞作為AD細胞模型，通過Westernblotting分析了神經元樣細胞細胞中不同系統(tǒng)相關蛋白的表達情況。Aβ1-42顯著促進了C4a的表達，而肝素及其衍生物對C4a表達的抑制作用與肝素的硫酸基及分子量密切相關。6-O-硫酸基和N-硫酸基對于肝素抑制C4a表達的活性是必需的。十六糖或以上的肝素糖鏈才可能具有抑制C4a表達的活性。
　　Aβ1-42也能顯著