白藜蘆醇對(duì)顳葉癲癇大鼠不同發(fā)作時(shí)期海馬神經(jīng)元GluR6和GABAAR-α1表達(dá)量的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、目的：
　　應(yīng)用腦立體定位技術(shù)在大鼠海馬CA3中心區(qū)通過(guò)微量注射海人草酸(kainic acid),建立顳葉癲癇大鼠模型,以此模型為基礎(chǔ),從行為學(xué)和分子生物學(xué)兩方面觀察模型動(dòng)物于癲癇不同發(fā)作時(shí)期其發(fā)作頻率及海馬神經(jīng)元GluR6和GABAR-α1表達(dá)量的變化,分析在顳葉癲癇發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中大鼠海馬神經(jīng)元中 GluR6和GABAR-α1表達(dá)量變化趨勢(shì)以及白藜蘆醇(resveratrol,Res)對(duì)該表達(dá)量變化的調(diào)節(jié)作用,并評(píng)價(jià)其抗癲癇

2、效果及作用機(jī)制。
　　方法：
　　1.動(dòng)物模型建立雄性Wistar大鼠,體重220-260克,清潔級(jí)。水合氯醛(350mg/kg,i.p.)麻醉動(dòng)物后,用腦立體定位技術(shù)在大鼠海馬CA3中心區(qū)(AP:-4.0mm,ML:-4.4 mm,DV:3.8mm)緩慢注射KA2.5μl(0.4μg/μl),約10min注射完畢,留針3-5min,縫合頭皮。按Racine分級(jí)法對(duì)癲癇發(fā)作程度進(jìn)行分級(jí),選發(fā)作級(jí)別達(dá)Ⅳ級(jí)以上的大鼠用于下一步實(shí)

3、驗(yàn)觀察。對(duì)照組大鼠在同樣的腦區(qū)注射等量的生理鹽水。
　　2.動(dòng)物分組按癲癇不同發(fā)作時(shí)期的行為學(xué)表現(xiàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行分組,急性期(3d)、平靜期(14d)、慢性期(60d)。并根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求將動(dòng)物分為:生理鹽水對(duì)照組(NS組)、癲癇模型組(KA組)、KA+Res治療組(Res組,15mg/kg/d)。急性期癲癇大鼠在首次急性大發(fā)作后即通過(guò)灌胃給藥,每天1次,持續(xù)3 d;靜止期和慢性期癲癇大鼠在首次急性大發(fā)作后即通過(guò)灌胃給藥,每天1次,持

4、續(xù)10d。3.行為學(xué)觀察將手術(shù)后的大鼠飼養(yǎng)于裝有視頻監(jiān)控的動(dòng)物房?jī)?nèi),自由進(jìn)食飲水,自然采光,室溫維持在23oC±1oC。每天監(jiān)控8h,每周監(jiān)控5d,對(duì)各組大鼠進(jìn)行連續(xù)視頻監(jiān)控,從行為表現(xiàn)上統(tǒng)計(jì)癲癇不同發(fā)作時(shí)期各組大鼠癇樣發(fā)作的個(gè)體數(shù)。
　　4.Western Blot分析7％水合氯醛經(jīng)腹腔注射麻醉(ml/kg)大鼠后立即斷頭取腦,冰上小心分離出海馬,置于EP管中經(jīng)-80oC凍存。用腦組織蛋白裂解液提取海馬內(nèi)全蛋白,利用BCA法測(cè)蛋

5、白濃度。取樣本于10%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳后,蛋白80V恒壓濕轉(zhuǎn)入PVDF膜上,5%脫脂牛奶室溫封閉30 min,孵一抗4 oC過(guò)夜,0.05%PBS-T洗膜3×10min,室溫共同孵育二抗和HRP-GAPDH抗體1.5h,0.05%PBS-T洗膜3×10 min,暗室中ECL顯色后曝光。
　　5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,組間差異使用單因素方差分析,組內(nèi)差異使用LSD法進(jìn)行比較,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±

6、s表示,p<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)果：
　　1.行為學(xué)觀察顳葉癲癇大鼠模型的成功率達(dá)到97.0%(62/64)。NS組未見(jiàn)任何形式癲癇發(fā)作;癲癇發(fā)作急性期:KA組大鼠癇樣發(fā)作率為87.5%(7/8),Res組大鼠癇樣發(fā)作率為75.0%(6/8);靜止期:KA組大鼠癇樣發(fā)作率為0(0/8)，Res組大鼠癇樣發(fā)作率為0(0/8);慢性期:KA組大鼠自發(fā)發(fā)作率為87.5%(7/8),Res組大鼠自發(fā)發(fā)作率為12.5%(1

7、/8)。
　　2.Western Blot分析與NS組大鼠相比較,在癲癇發(fā)作急性期,KA組海馬神經(jīng)元中GluR6和GABAAR-α1表達(dá)明顯減少(n=8,p<0.05),Res組GluR6和GABAAR-α1表達(dá)有所恢復(fù)(n=8,p>0.05),但仍低于對(duì)照組。靜止期,KA組海馬神經(jīng)元GluR6和GABAAR-α1的表達(dá)幾乎檢測(cè)不到(n=8,p<0.05),而Res組海馬神經(jīng)元GluR6和GABAAR-α1表達(dá)有所恢復(fù),但仍然沒(méi)有

8、達(dá)到對(duì)照組水平。慢性期,KA組海馬神經(jīng)元GluR6和GABAAR-α1表達(dá)量明顯增多(n=8,p<0.05),Res組海馬神經(jīng)元GluR6表達(dá)量有所恢復(fù)(n=8,p>0.05),而GABAAR-α1表達(dá)量仍明顯增多(n=8,p<0.05),且明顯地高出對(duì)照組。
　　結(jié)論：
　　1.Res能較強(qiáng)的抑制kainate誘導(dǎo)的顳葉癲癇大鼠的癇樣自發(fā)發(fā)作,對(duì)顳葉癲癇的發(fā)生和發(fā)展具有一定的抑制作用。
　　2.Kainate誘導(dǎo)的顳