CIC-2對慢性顳葉癲癇大鼠海馬CA1區(qū)α5亞基-GABAAR介導(dǎo)緊張性抑制的影響.pdf

1、顳葉癲癇是一組以反復(fù)癲癇發(fā)作、學(xué)習(xí)記憶功能減退為主要臨床表現(xiàn)的疾病。以往的研究表明，它與海馬局部神經(jīng)元退行性變、膠質(zhì)增生、異常環(huán)路重構(gòu)以及腦內(nèi)興奮-抑制作用失衡有關(guān)。在成年動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，GABA作為主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，通過GABA-R起作用。其中，GABAAR主要通過介導(dǎo)C1-內(nèi)流引起細(xì)胞超極化而發(fā)揮抑制作用。根據(jù)GABAAR的分布和激活后的電生理特性，可以將GABAAR粗略地分成兩大類：synaptic GABAAR和extr

2、asynapticGABAAR，前者介導(dǎo)GABAergic的時相性抑制(phasic inhibition)，后者介導(dǎo)GABAergic的緊張性抑制(tonic inhibition)。近年來，extrasynaptic GABAAR介導(dǎo)的緊張性抑制吸引了越來越多學(xué)者的關(guān)注。但無論是時相性還是緊張性抑制，均依賴于神經(jīng)元內(nèi)低氯狀態(tài)。
　　 有研究表明，GABAAR激活后，氯離子內(nèi)流和碳酸氫根離子外流是相藕聯(lián)的，由于碳酸酐酶的作用可

3、維持細(xì)胞內(nèi)碳酸氫根離子的高濃度，所以，碳酸氫根離子可持續(xù)的順濃度梯度大量外流，同時，氯離子亦大量內(nèi)流，從而介導(dǎo)突觸后抑制作用。如果氯離子在短時間內(nèi)不能有效排出細(xì)胞外，以保持細(xì)胞內(nèi)的低氯環(huán)境，反復(fù)激活GABAAR會引起細(xì)胞內(nèi)氯離子超載，后者可增加氯離子內(nèi)流的阻抗，使突觸后抑制作用明顯減弱。因此，向胞外轉(zhuǎn)運(yùn)氯離子的能力對于維持神經(jīng)元正常的GABAergic抑制作用顯得尤為重要，氯離子穩(wěn)態(tài)的打破有可能參與了異常放電的形成，而并非僅僅是異常放電

4、的結(jié)果。細(xì)胞內(nèi)外氯離子的濃度梯度主要是由一組陽離子-氯離子同向轉(zhuǎn)運(yùn)體和氯通道共同調(diào)節(jié)。C1C-2是電壓門控性氯通道中的一種，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外氯離子濃度、維持細(xì)胞膜電位等。已有研究表明，在癲癇模型中，作為成熟神經(jīng)元上主要的氯離子外向轉(zhuǎn)運(yùn)體KCC2明顯下調(diào)?？紤]到C1C-2本身的特性，即在膜內(nèi)電位低于膜平衡電位時被激活，產(chǎn)生內(nèi)向整流，電導(dǎo)大，且該通道的失活無明顯時間依賴性。那么，在癲癇病理狀態(tài)下，C1C-2有何改變？
　　 Rink

5、e用C1C-2基因敲除小鼠證實(shí)，在細(xì)胞內(nèi)高氯的狀態(tài)下，C1C-2有一定的外向轉(zhuǎn)運(yùn)氯離子的作用，且承擔(dān)了相當(dāng)一部分的背景電導(dǎo)以維持膜電位的穩(wěn)定，但野生型和基因敲除小鼠的mIPSP、sIPSP和PPR均沒有顯著性差異，說明C1C-2與GABAAR介導(dǎo)的時相性抑制無關(guān)。有研究表明，在成年動物海馬CA區(qū)，GABAergic的緊張性抑制主要是由α5亞基-GABAAR介導(dǎo)。我們要研究的問題是：C1C-2是否與α5亞基-GABAAR介導(dǎo)緊張性抑制有關(guān)

6、？即藥物阻斷α5亞基-GABAAR是否引起C1C-2電流的改變？在癲癇病理狀態(tài)下，C1C-2電流有何改變？α5亞基-GABAAR介導(dǎo)的緊張性抑制本身有何改變？這種改變對大鼠慢性期SRS發(fā)作有何影響？在體阻斷α5亞基-GABAAR能否改善大鼠海馬的突觸可塑性？
　　 第一部分匹羅卡品致病大鼠的行為學(xué)特征及海馬神經(jīng)元損傷的表現(xiàn)
　　 目的：觀察匹羅卡品致癇大鼠的行為學(xué)特征及海馬CA1區(qū)神經(jīng)元損傷的情況。
　　 方法：

7、雄性SD大鼠(180-200g)隨機(jī)分成對照組、致癇組，為了解大鼠致癇后不同時期的行為學(xué)特征、海馬神經(jīng)元的損傷情況以及目的蛋白表達(dá)的變化，根據(jù)致癇后自然病程的長短，將致癇組分為：急性期組(致癇后24小時)、潛伏期組(致癇后5天)、慢性期組(出現(xiàn)SRS后14天)和晚期組(出現(xiàn)SRS后30天)。致癇組給予匹羅卡品(340mg/kg，i.p.)致癇，致癇前30min給予阿托品(5mg/kg，i.p.)減輕外周膽堿能作用。如果首劑匹羅卡品注射一

8、小時后仍沒有點(diǎn)燃，可以追加一次匹羅卡品(170mg/kg，i.p.)。點(diǎn)燃的行為學(xué)表現(xiàn)以出現(xiàn)節(jié)律性點(diǎn)頭、咀嚼、濕狗樣抖動、繼而直立、跌倒為判斷標(biāo)準(zhǔn)?；瘜W(xué)點(diǎn)燃后90min給予地西泮(10mg/kg，i.p.)終止發(fā)作，之后使用數(shù)字?jǐn)z像機(jī)持續(xù)視頻監(jiān)測大鼠的行為學(xué)表現(xiàn)，并記錄潛伏期、首次SRS發(fā)作的時間、慢性期SRS的發(fā)作頻率及發(fā)作持續(xù)時間等。采用視頻采集卡進(jìn)行后期資料的采集和分析。對照組除了以生理鹽水代替匹羅卡品外，其他處理與致癇組完全一致

9、。
　　 應(yīng)用免疫熒光標(biāo)記NeuN來觀察對照組和致癇后各組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的形態(tài)及數(shù)量，評估CA1區(qū)神經(jīng)元的存活情況。免疫熒光染色結(jié)果的定量分析，采用連續(xù)冠狀位冰凍切片(20μm)，每隔3張腦片取1張，每只大鼠選取5張腦片進(jìn)行CA1區(qū)NeuN陽性細(xì)胞的計(jì)數(shù)，通過計(jì)算得出每只大鼠CA1區(qū)NeuN陽性細(xì)胞的均數(shù)及各組大鼠CA1區(qū)NeuN陽性細(xì)胞的均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤。實(shí)驗(yàn)結(jié)果均用均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)誤表示，先用單因素方差分析(one-way A

10、NOVA)處理數(shù)據(jù)，然后用Tukey法(Tukey's post hoc tests)檢測組間差異。
　　 結(jié)果：致癇組大鼠在注射匹羅卡品后24±3 min(n=51)被點(diǎn)燃，SE發(fā)作(statusepilepticus)均達(dá)4～5級。注射地西泮并不能立刻終止發(fā)作，但可以減輕發(fā)作強(qiáng)度、增加存活率。除7只大鼠死亡外，其余致癇組大鼠均存活。在注射地西泮5～7小時后，大鼠SE發(fā)作逐漸緩解。隨后，致癇組大鼠進(jìn)入發(fā)作后狀態(tài)，持續(xù)約2～3天

11、，期間大鼠仍有自限性的4～5級癇樣發(fā)作(持續(xù)時間：10±3 min；平均發(fā)作頻率：5±2次/天，n=38)，需要人工喂食，以流質(zhì)為主。接下來，致癇大鼠經(jīng)過一段長約9±1天(n=38)的潛伏期，在這段時期內(nèi)大鼠無自發(fā)性癇樣發(fā)作，可以自主攝食，但進(jìn)食量及活動量與對照組相比明顯減少，體重不增。首次自主發(fā)作(The first spontaneous recurrent seizure，SRS)出現(xiàn)在致癇后第12±1天(n=28)。有4只大鼠因

12、未出現(xiàn)SRS或SRS發(fā)作形式無明顯叢集性而從實(shí)驗(yàn)中刪除。其余大鼠均有穩(wěn)定的SRS發(fā)作(平均發(fā)作持續(xù)時間：4±2 min；平均發(fā)作頻率：4±1次/天，n=28)。
　　 匹羅卡品致癇模型主要表現(xiàn)為DG門區(qū)及CA3區(qū)錐體細(xì)胞的凋亡，而CA1區(qū)的錐體細(xì)胞相對被保留。與對照組相比，致癇后各組大鼠海馬CA1區(qū)NeuN陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 小結(jié)：
　　 1、致癇組大鼠的首次自主發(fā)作(SRS)出現(xiàn)在致癇后第12

13、±1天(Mean±SEM，n=28)。
　　 2、慢性期和晚期組致癇大鼠均有穩(wěn)定的SRS叢集性發(fā)作，平均發(fā)作持續(xù)時間4±2 min，平均發(fā)作頻率4±1次/天(Mean±SEM，n=28>。
　　 3、與對照組相比，致癇后不同時期組大鼠海馬CA1區(qū)NeuN陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，即致癇后CA1區(qū)的錐體細(xì)胞相對被保留。
　　 第二部分 C1C-2在大鼠海馬的定位以及對照組和致病后各組海馬CA1區(qū)C1C-2蛋白的

14、定量分析
　　 目的：觀察C1C-2在大鼠海馬CA1區(qū)的定位；比較對照組和致癇后各組大鼠海馬CA1區(qū)C1C-2的表達(dá)量。
　　 方法：應(yīng)用免疫熒光雙染技術(shù)對C1C-2進(jìn)行組織學(xué)定位，單染技術(shù)比較對照組和致癇后各組C1C-2的表達(dá)情況。參考第一部分制做動物模型，分別取對照組、急性期組、潛伏期組、慢性期組和晚期組大鼠進(jìn)行麻醉(烏拉坦1.5 g/Kg，i.p.)，經(jīng)心臟灌注(肝素化生理鹽水250ml，后接4％多聚甲醛400ml

15、)。解剖動物，取出大鼠腦組織，4％多聚甲醛后固定，然后轉(zhuǎn)入30％蔗糖溶液中。標(biāo)本脫水后進(jìn)行連續(xù)冰凍切片，腦片收集于0.01M PBS溶液中，切片厚度均為20μm，腦片用0.01M PBS溶液漂洗后，室溫下用封閉液封閉1小時，以結(jié)合非特異性結(jié)合位點(diǎn)。棄去封閉液后加入一抗4℃過夜。吸去一抗后用0.01M PBS溶液漂洗三次，加入二抗避光室溫孵育2小時，0.01M PBS溶液漂洗，避光貼片，置于熒光顯微鏡下觀察并拍照。Western Blot

16、檢測對照組和致癇后各組大鼠海馬CA1區(qū)C1C-2的表達(dá)量。取對照組和致癇后各組大鼠，快速斷頭取腦，將腦組織置于冰上，顯微鏡下分離出海馬CA1區(qū)的組織，放入樣品緩沖液中，加入蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，冰上勻漿、超聲破碎，取上清液分裝保存于-80℃。酶聯(lián)免疫吸附法測定上清液中C1C-2的含量。蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果的半定量分析，應(yīng)用生物凝膠圖像分析系統(tǒng)掃描，Genegenius凝膠圖像分析系統(tǒng)攝取圖片并獲得條帶灰度值，GeneTool軟件進(jìn)

17、行濃度的定量分析，以β-actin作為內(nèi)參。先用單因素方差分析(one-way ANOVA)處理數(shù)據(jù)，再用Tukey法(Tukey's post hoc tests)比較對照組和致癇后各組的組間差異。
　　 結(jié)果：免疫熒光雙染結(jié)果發(fā)現(xiàn)：C1C-2主要定位大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞的胞體上，在錐體細(xì)胞的頂樹突近端也有C1C-2相對較低的表達(dá)。C1C-2與星型膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞之間沒有共染。單染結(jié)果顯示，致癇組大鼠海馬CA1區(qū)的C1

18、C-2IR增強(qiáng)，尤其是錐體細(xì)胞頂樹突區(qū)的C1C-2 IR信號明顯增強(qiáng)，而錐體細(xì)胞胞體上的C1C-2 IR無明顯改變，這一現(xiàn)象在進(jìn)入慢性期和晚期的癲癇大鼠腦片上尤為明顯。
　　 Western Blot結(jié)果顯示，致癇后急性期組大鼠CA1區(qū)的ClC-2蛋白表達(dá)量與對照組相比無顯著差異，慢性期組和晚期組C1C-2蛋白表達(dá)量明顯高于對照組。
　　 小結(jié)：
　　 1、對照組大鼠海馬CA1區(qū)C1C-2與錐體細(xì)胞存在共染，在錐

19、體細(xì)胞的胞體高表達(dá)，頂樹突區(qū)近端也有相對較低水平的表達(dá)。
　　 2、致癇后，尤其是進(jìn)入慢性期的大鼠，錐體細(xì)胞的頂樹突區(qū)C1C-2 IR明顯增強(qiáng)，而錐體細(xì)胞的胞體上C1C-2 IR無明顯改變。
　　 3、與對照組相比，慢性期組和晚期組CA1區(qū)C1C-2的表達(dá)量明顯上調(diào)。
　　 第三部分海馬CA1區(qū)C1C-2功能性上調(diào)與α5亞基-GABAAR介導(dǎo)的緊張性抑制有關(guān)
　　 目的：研究慢性顳葉癲癇大鼠海馬CA1區(qū)C

20、1C-2表達(dá)上調(diào)是否具有功能；該區(qū)α5亞基-GABAAR介導(dǎo)的緊張性抑制有何改變；C1C-2與α5亞基-GABAAR介導(dǎo)的緊張性抑制是否有關(guān)。
　　 方法：選取對照組和慢性期組大鼠制作海馬腦片，全細(xì)胞模式記錄海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞的C1C-2電流和α5亞基-GABAAR介導(dǎo)的緊張性抑制電流(Itonic)，比較對照組和慢性期組C1C-2電流和Itonic的變化；觀察應(yīng)用特異性α5亞基-GABAARs阻斷劑(L-655，708)干預(yù)

21、后C1C-2電流和Itonic的改變。將大鼠快速斷頭取腦，腦組織浸入4℃切片液中，振動切片機(jī)冠狀位切片(400μm)，將腦片轉(zhuǎn)置32℃的人工腦脊液中孵育1h后記錄。切片液、人工腦脊液需事先通混合氣(含95％氧氣和5％二氧化碳)至少30min。記錄槽內(nèi)持續(xù)循環(huán)灌注細(xì)胞外液(5ml/min)。將腦片置于記錄槽中，在紅外相差顯微鏡下，全細(xì)胞模式記錄CA1區(qū)錐體細(xì)胞的C1C-2電流(鉗制電壓：-10mV，測試電壓：+40mV～120mV，躍級增

22、量：-20mV)，消除液接電位、吉?dú)W封接、破膜、補(bǔ)償電極電容和膜電容，穩(wěn)定5min后開始記錄，濾波2Hz，采樣20Hz。觀察對照組和慢性期組大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞的C1C-2電流的差別。外液中加入L-655，708(100nM)后，記錄C1C-2電流的變化。全細(xì)胞模式記錄Itonic，鉗制電壓-60mV，在細(xì)胞外液加入TTX(200nM)、Kynurenic acid(3mM)和CGP-52432(5μM)分別阻斷動作電位、興奮性谷氨

23、酸受體電流和GABABR，同時補(bǔ)充外源性GABA(5μM)后，記錄GABAAR介導(dǎo)的電流，基線記錄平穩(wěn)后，在細(xì)胞外液中加入適當(dāng)濃度的L-655，708(100nM)選擇性阻斷介導(dǎo)緊張性抑制的α5亞基-GABAAR，電流平穩(wěn)后再加入飽和濃度的SR-95531(100μM)完全阻斷介導(dǎo)時相性和緊張性抑制的所有GABAAR。選取采樣點(diǎn)：加藥前100s(t1)、L-655，708加藥后200s(t2)和SR-95531加藥后100s(t3)，采

24、集并計(jì)算出加藥前后t1、t2、t3電流的平均增量，即△Ihold t3-t1和△Ihold t3-t2，△Ihold t3-t1代表GABAAR介導(dǎo)的總電流，△Ihold t3-t2代表GABAAR介導(dǎo)的時相性抑制電流的成分。通過計(jì)算(∣△Ihold t3-t1-△Ihold t3-t2∣)可以得到α5亞基-GABAAR介導(dǎo)的緊張性性抑制電流Itonic。每組大鼠的△Ihold t3-t1和△Ihold t3-t2均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤來表示

25、。比較單個神經(jīng)元加藥前后的差異用KS法(Kolmogorov-Smirnov test)；檢測組間差異先用單因素方差分析(one-way ANOVA)處理數(shù)據(jù)，然后用Tukey法(Tukey'spost hoc tests)。
　　 手術(shù)置入側(cè)腦室給藥管(外徑0.7mm、內(nèi)徑0.36mm的套管)，位置：前囟后0.5mm旁開1.2mm深4mm。用牙托粉固定套管，術(shù)后7天匹羅卡品致癇，致癇大鼠進(jìn)入潛伏期開始側(cè)腦室給予L-655，70

26、8，每天兩次(9am～9pm)，每次側(cè)腦室注射量為5μl，持續(xù)給藥至SRS出現(xiàn)后14天。實(shí)驗(yàn)分為給藥組和空白對照組。根據(jù)L-655，708濃度的不同，給藥組又分為2μM、4μM、8μM和16μM組，觀察該藥對大鼠行為學(xué)的影響。記錄給藥各組首次SRS發(fā)作的時間、慢性期SRS發(fā)作頻率和發(fā)作持續(xù)時間，與空白組進(jìn)行比較。
　　 結(jié)果：癲癇慢性期組的C1C-2電流較對照組增大了53.2％(對照組：453.1±47.4 pA，n=9；癲癇組

27、：694.5±56.2 pA，n=12；P<0.05)。外液中加入100 nM L-655，708后C1C-2電流減小了26.9％(空白組：702.3±63.1 pA，n=10；給藥組：513.6±50.2pA，n=15；P<0.05)。癲癇組α5亞基-GABAAR介導(dǎo)的緊張性抑制電流(Itonic)明顯大于對照組(對照組：132.1±17.9 pA，n=12；癲癇組：207.4±13.6 pA，n=15；P<0.05)。L-655，7

28、08可顯著抑制癲癇組Itonic(-30.3±7.9％，n=11，P<0.05)，但對于對照組Itonic則無明顯影響(-21.6±9.2％，n=7，P>0.05)。
　　 側(cè)腦室給予致癇大鼠不同濃度的L-655，7088并觀察大鼠行為學(xué)表現(xiàn)，8μM和16μM組大鼠首次SRS出現(xiàn)的時間早于空白組(給藥組9±1天，n=7，空白組：12±1天，n=7；P<0.05)，但慢性期SRS發(fā)作頻率和發(fā)作持續(xù)時間未見顯著組間差異。
　　

29、 小結(jié)：
　　 1、癲癇組ClC-2電流較對照組明顯增大，說明在病理狀態(tài)下海馬CA1區(qū)C1C-2表達(dá)上調(diào)是有功能的。
　　 2、癲癇組海馬CA1區(qū)α5亞基-GABAAR介導(dǎo)的緊張性抑制電流(Itonic)顯著大于對照組；L-655，708可顯著抑制癲癇組Itonic，但對于對照組Itonic則無明顯抑制作用。說明對照大鼠腦組織中是以時相性抑制為主，緊張性抑制做為一種背景電流；而在癲癇大鼠腦組織中α5亞基-GABAAR介

30、導(dǎo)的緊張性抑制電流明顯增強(qiáng)，可能是對病理狀態(tài)下時相性抑制減弱的一種代償現(xiàn)象。
　　 3、離體腦片上應(yīng)用L-655，708可翻轉(zhuǎn)癲癇組增大的C1C-2電流。說明病理狀態(tài)下，C1C-2功能性上調(diào)與α5亞基-GABAAR介導(dǎo)的Itonic代償性增強(qiáng)有關(guān)。
　　 4、在體動物側(cè)腦室注射L-655，708可使致癇大鼠首次SRS提早出現(xiàn)，但對慢性期SRS發(fā)作頻率和發(fā)作持續(xù)時間無明顯影響。說明Itonic增強(qiáng)可以延長SE發(fā)作后的潛伏期

31、，延緩SRS的出現(xiàn)，即α5亞基-GABAAR介導(dǎo)的緊張性抑制與SRS的形成有關(guān)，與慢性期SRS反復(fù)發(fā)作無關(guān)。
　　 第四部分α5亞基-GABAAR介導(dǎo)的緊張性抑制對慢性顳葉癲癇大鼠海馬突觸可塑性的影響
　　 目的：研究癲癇組(慢性期)大鼠海馬CA1區(qū)突觸可塑性有何改變；應(yīng)用α5亞基-GABAAR特異性阻斷劑對慢性顳葉癲癇大鼠海馬LTP/LTD的誘導(dǎo)有何影響。
　　 方法：本部分實(shí)驗(yàn)應(yīng)用在體記錄大鼠海馬CA1區(qū)場電

32、位的技術(shù)。以20％烏拉坦(7.5ml/kg i.p.)麻醉動物，將大鼠頭部固定于腦立體定位儀上，以H2O2清除皮下組織和筋膜，充分暴露顱骨中縫和前囟。在顱骨上標(biāo)記刺激電極(前囟后4.2mm，中線左側(cè)旁開3.8mm，深3200～3500μm)、記錄電極(前囟后3.4mm，中線左側(cè)旁開2.5mm，深2200～2500μm)和側(cè)腦室給藥管(前囟后0.5 mm，中線右側(cè)旁開1.0 mm，深4000μm)的位置，用電鉆在標(biāo)記點(diǎn)上鉆孔，借助微電極操

33、作儀將電極和給藥管緩慢送入目標(biāo)位置。用牙托粉將不銹鋼給藥管固定，自然晾干。連續(xù)單方波刺激海馬Schaffer collateral pathway的同時，在CA1區(qū)輻射層記錄Schaffer→CA1的興奮性突觸后場電位(field excitatory post-synapticpotentials，fEPSPs)。高頻刺激(100 Hz，每串50個刺激，每串間隔15s，4串)誘導(dǎo)海馬LTP；低頻刺激(1 Hz，900個刺激，15min

34、)誘導(dǎo)海馬LTD。給予條件刺激之前，應(yīng)用測試刺激至少穩(wěn)定記錄30min做為baseline；側(cè)腦室給藥后需繼續(xù)記錄至少30min再誘導(dǎo)LTP/LTD，以觀察藥物本身對電位是否有影響。給藥時先用微量注射器緩慢推注5μ1(L-655，708或vehicle)，時間控制在2min左右，再用輸液微泵維持至實(shí)驗(yàn)結(jié)束(推速：0.5μl/h)。該實(shí)驗(yàn)以海馬CA1區(qū)fEPSPs的幅度作為提取參數(shù)，每10個連續(xù)的測試刺激做一次平均，以加藥前或條件刺激前海

35、馬fEPSPs幅度的均值做為對照，所得數(shù)據(jù)由LTP、SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，比較加藥前、后的差異用Wilcoxon signed ranks檢驗(yàn)，組間比較用Kruskal-Wallis test檢驗(yàn)。
　　 Western Blot檢測對照組和癲癇組(慢性期)大鼠海馬CA1區(qū)NR1、NR2A、NR2B、GluR1、GluR2和GluR3的表達(dá)量。在體實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，分別取對照組和癲癇組大鼠腦組織，顯微鏡下分離，放入樣品緩沖

36、液中，加入蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，冰上勻漿、超聲破碎，取上清液分裝保存于-80℃。酶聯(lián)免疫吸附法測定上清液中上述目的蛋白的含量。蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果的半定量分析，應(yīng)用生物凝膠圖像分析系統(tǒng)掃描，Genegenius凝膠圖像分析系統(tǒng)攝取圖片并獲得條帶灰度值，GeneTool軟件進(jìn)行濃度的定量分析，以β-actin作為內(nèi)參。先用單因素方差分析(one-way ANOVA)處理數(shù)據(jù)，然后用Tukey法(Tukey's post hoc te

37、sts)比較對照組和癲癇組的組間差異。
　　 結(jié)果：高頻刺激(high-frequency stimulation，HFS)誘導(dǎo)癲癇組海馬CA1區(qū)fEFSPs的幅度顯著低于對照組(癲癇組：128.5±9.43％，n=5；對照組：150.9±7.57％，n=5，P<0.05)；低頻刺激(low-frequency stimulation，LFS)誘導(dǎo)癲癇組海馬CA1區(qū)fEFSPs幅度顯著高于對照組(癲癇組：117.2±6.22％，

38、n=5；對照組：68.3±7.31％，n=5，P<0.05)。L-655，708對高頻刺激誘導(dǎo)海馬LTP的fEFSPs幅度無明顯影響(給藥組：132.4±7.01％，n=5；空白組：130.3±7.36％，n=4，P>0.05)；L-655，708可部分抑制低頻刺激誘導(dǎo)海馬LTD的fEFSPs幅度(給藥組：91.6±6.57％，n=5；空白組：113.7±6.91％，n=4，P<0.05)。
　　 應(yīng)用Western Blot技

39、術(shù)檢測對照組和癲癇組大鼠海馬CA1區(qū)NR1、NR2A、NR2B、GluR1、GluR2和GluR3的表達(dá)量。癲癇組NR1和NR2A的表達(dá)量明顯高于對照組；而NR2B的表達(dá)量顯著減低。癲癇組GluR2的表達(dá)量明顯低于對照組，同時GluR1和GluR3顯著增高，癲癇組GluR2/GluR1+GluR3比值顯著低于對照組。
　　 小結(jié)：
　　 1、高頻刺激誘導(dǎo)癲癇組海馬CA1區(qū)LTP的fEFSPs幅度顯著低于對照組；低頻刺激誘

40、導(dǎo)癲癇組海馬CA1區(qū)fEFSPs幅度則明顯高于對照組，并翻轉(zhuǎn)形成LTP。說明癲癇組大鼠強(qiáng)化記憶的功能明顯減退，同時糾錯和刪除記憶的功能也有所削弱。
　　 2、L-655，708對高頻刺激誘導(dǎo)海馬LIP的fEFSPs幅度無明顯影響：可部分抑制低頻刺激誘導(dǎo)海馬LTD的fEFSPs幅度。說明L-655，708可以改善癲癇大鼠的糾錯和刪除記憶功能，避免LTP過飽和，從而維持相鄰?fù)挥|LTP的誘導(dǎo)閾值。
　　 結(jié)論
　　 正

41、常大鼠中，C1C-2主要定位于海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞的胞體上，在錐體細(xì)胞頂樹突的近端也有相對較低水平的表達(dá)。致癇后，尤其是進(jìn)入慢性期的大鼠，海馬CA1區(qū)C1C-2的表達(dá)量明顯上調(diào)，且具有功能性，以錐體細(xì)胞頂樹突區(qū)的C1C-2上調(diào)顯著。
　　 慢性顳葉癲癇大鼠海馬CA1區(qū)α5亞基-GABAAR介導(dǎo)的緊張性抑制電流(Itonic)顯著增大；在離體腦片上應(yīng)用L-655，708可顯著抑制Itonic并翻轉(zhuǎn)增大的C1C-2電流。致癇后，持續(xù)