卵巢癌患者腹水來源exosome對機(jī)體抗卵巢癌免疫功能影響的實驗研究及其蛋白質(zhì)組成分析.pdf

1、本研究為了進(jìn)一步了解卵巢癌患者腹水來源exosome對特異性抗卵巢癌細(xì)胞免疫功能的影響及其相關(guān)機(jī)制，探索exosome的蛋白質(zhì)組成，進(jìn)行了下列五部分實驗。 第一部分卵巢癌患者腹水來源exosome的分離、鑒定和定量。 目的：從卵巢癌患者腹水中分離exosome，并對其進(jìn)行鑒定和定量。 方法：采集41例卵巢上皮性癌患者的腹水，通過差速離心結(jié)合密度屏障超速離心的方法分離腹水中的exosome，使用透射電鏡和Weste

2、rn Blot方法對exosome進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定和分子標(biāo)記物鑒定。通過Bradford蛋白質(zhì)定量法對exosome進(jìn)行間接定量。 結(jié)果：在85.4％(35/4.1)的卵巢癌患者腹水中成功的分離獲得exosome，但是含有雜蛋白聚合體。電鏡形態(tài)學(xué)鑒定和Western Blot分子標(biāo)志鑒定的符合性良好。每毫升腹水中可以獲得exosome的量為(1.1±0.7)μg。 結(jié)論：從絕大多數(shù)卵巢癌患者腹水中能夠分離獲得典型的exos

3、ome。Bradford蛋白定量法是一種簡便的exosome間接定量法，但是并非最準(zhǔn)確的方法。 第二部分卵巢癌患者腹水來源exosome刺激的淋巴細(xì)胞對卵巢癌細(xì)胞殺傷作用的研究。 目的：探索卵巢癌腹水來源的exosome能否在體外環(huán)境下，改變抗原呈遞細(xì)胞和淋巴細(xì)胞參與的特異性殺傷卵巢癌細(xì)胞的免疫反應(yīng)。 方法：體外分離培養(yǎng)自體卵巢癌細(xì)胞、外周血淋巴細(xì)胞和臍血誘導(dǎo)分化樹突細(xì)胞，將腹水中得到的exosome分別加入樹突

4、細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的混合培養(yǎng)體系以及淋巴細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)體系中，7天后用經(jīng)過刺激的淋巴細(xì)胞殺傷自體腫瘤細(xì)胞和卵巢癌細(xì)胞系SKOV3，改良MTT法計算淋巴細(xì)胞的抗卵巢癌細(xì)胞毒活性變化，ELISA法測定exosome刺激前后以及不同的刺激組間IFN-γ釋放水平的變化。 結(jié)果：實驗中成功的分離、培養(yǎng)了自體卵巢癌細(xì)胞和外周血淋巴細(xì)胞，從臍血中成功分離誘導(dǎo)獲得樹突細(xì)胞。樹突細(xì)胞和淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)體系中加入exosome后淋巴細(xì)胞對卵巢癌細(xì)胞的殺傷

5、率為(6.8±1 5.8)％，而樹突細(xì)胞存在時未加exosome組的淋巴細(xì)胞對卵巢癌細(xì)胞的殺傷率為(16.0±25.9)％；exosome+淋巴細(xì)胞組和單獨(dú)淋巴細(xì)胞組的殺傷率分別為(16.9±30.8)％和(16.0±22.5)％。不論靶細(xì)胞是來自自體腫瘤細(xì)胞還是SKOV3細(xì)胞系，也不論效應(yīng)細(xì)胞來自卵巢癌患者外周血還是非腫瘤研究對象的外周血，上述實驗結(jié)果均一致。在樹突細(xì)胞和淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)體系中加入exosome后，IFN-γ的釋放水平

6、為(30.1±9.8)pg/ml；未加exosome組為(34.9±12.4)pg/ml；exosome+淋巴細(xì)胞組和單純淋巴細(xì)胞組分別為(33.0±10.0)pg/ml和(29.2±7.1)pg/ml。將各組淋巴細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞共同培養(yǎng)48小時后，IFN-γ的釋放水平?jīng)]有明顯的變化。 結(jié)論：在樹突細(xì)胞存在的條件下，exosome降低外周血淋巴細(xì)胞對卵巢癌細(xì)胞的殺傷活性。exosome對淋巴細(xì)胞釋放IFN-γ的水平?jīng)]有影響。

7、 第三部分卵巢癌患者腹水來源exosome對卵巢癌細(xì)胞生長和凋亡的影響。 目的：探索腹水來源的exosome對卵巢癌細(xì)胞的生存是否產(chǎn)生影響。 方法：將腹水中獲得的exosome加入卵巢癌細(xì)胞ATC和SKOV3，定時測定細(xì)胞數(shù)目的變化；annexinV-PI雙染細(xì)胞后流式細(xì)胞儀測定上述細(xì)胞凋亡水平的變化，并在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行驗證。 結(jié)果：將來自不同劑量腹水的exosome加入卵巢癌細(xì)胞系SKOV3的培養(yǎng)基中，對S

8、KOV3細(xì)胞的生長速度沒有明顯的影響。通過流式細(xì)胞儀檢測，加入exosome后自體腫瘤細(xì)胞和SKOV3細(xì)胞的凋亡水平?jīng)]有明顯的變化。 結(jié)論：腹水來源exosome對卵巢癌細(xì)胞的生長和凋亡沒有明顯影響。 第四部分卵巢癌患者腹水來源exosome對抗卵巢癌細(xì)胞免疫功能的影響。 目的：初步探索卵巢癌腹水來源exosome可能影響機(jī)體抗腫瘤免疫功能的機(jī)制。 方法：將腹水中獲得的exosome加入樹突細(xì)胞和(或)淋

9、巴細(xì)胞的培養(yǎng)體系中，annexinV-PI雙染后通過流式細(xì)胞儀判斷上述細(xì)胞凋亡水平的變化，并在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行驗證；利用流式細(xì)胞儀檢測臍血中樹突細(xì)胞前體細(xì)胞在加入exosome后向樹突細(xì)胞誘導(dǎo)分化的程度是否發(fā)生改變；檢測加入exosome后總淋巴細(xì)胞中CD4<'+>淋巴細(xì)胞和CD8<'+>淋巴細(xì)胞的比例是否發(fā)生改變。Western Blot法和免疫電鏡技術(shù)鑒定exosome懸液中是否存在誘導(dǎo)凋亡信號FasL，使用抗FasL特異性抗體阻斷

10、FasI。可能引起的凋亡作用，判斷exosome攜帶的FasL在免疫細(xì)胞的凋亡中是否發(fā)生作用。Western Blot鑒定exosome懸液中是否存在Trail，DC和LC表面的Trail受體DR4和DR5通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行測定。 結(jié)果：在臍血樹突細(xì)胞前體細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入exosome后，3次獨(dú)立實驗中有一次樹突細(xì)胞前體細(xì)胞的凋亡增加。在沒有發(fā)生凋亡的實驗中，加入exosome獲得的樹突細(xì)胞在光鏡水平細(xì)胞形態(tài)和未加exosom

11、e組相比沒有差別。如果將exosome加入到成熟樹突細(xì)胞的培養(yǎng)基中，3次實驗中有2次觀察到凋亡水平增加。在誘導(dǎo)樹突細(xì)胞分化成熟的過程中，加入exosome組CD86的表達(dá)較未加exosome組有所升高(50.0±22.0)％和(38.6±13.3)％，其它樹突細(xì)胞的表面標(biāo)志沒有明顯的改變。在exosome+淋巴細(xì)胞組，CD4<'+>T細(xì)胞/CD8<'+>T細(xì)胞的比值為2.4±0.85，而未加exosome的淋巴細(xì)胞組為2.0±0.4。如

12、果加入樹突細(xì)胞，那么上述兩組CD4<'+>T細(xì)胞/CD8<'+>T細(xì)胞的比值分別為2.6±1.3和2.5±1.0。將exosome加入淋巴細(xì)胞培養(yǎng)體系后，5次實驗中2次觀察到淋巴細(xì)胞的凋亡增加；如果將exosome加入樹突細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的混合培養(yǎng)體系中，在6次實驗中3次觀察到淋巴細(xì)胞的凋亡增加。利用Western.Blot和免疫電鏡技術(shù)在exosome懸液中發(fā)現(xiàn)存在膜結(jié)合形式的FasL和Tail。不論樹突細(xì)胞還是淋巴細(xì)胞，使用抗：Fas

13、L抗體進(jìn)行阻斷實驗時，3次獨(dú)立實驗中有1次能夠?qū)xosome引起的凋亡降低到未加exosome的水平。利用流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)LC表達(dá)一定程度的Trail受體DR4，DC和LC表達(dá)低水平的Tail受體DR5，DC對DR4的表達(dá)亦極低。 結(jié)論：由于exosome攜帶有FasL和Trail，exosome可能誘導(dǎo)樹突細(xì)胞前體細(xì)胞、樹突細(xì)胞和淋巴細(xì)胞凋亡，并且這種誘導(dǎo)凋亡效應(yīng)能夠部分被抗FasL抗體所阻斷。因為LC表達(dá)一定的比例的DR4，

14、故exosome攜帶的Trail可能也參與了誘導(dǎo)LC凋亡的過程。所以淋巴細(xì)胞細(xì)胞毒活性的降低可能和exosome誘導(dǎo)其凋亡有關(guān)。exosome對腫瘤細(xì)胞的生長、樹突細(xì)胞的誘導(dǎo)分化以及CD4<'+>T細(xì)胞/CD8<'+>T細(xì)胞的比例沒有明顯的影響。 第五部分卵巢癌患者腹水來源exosome的蛋白質(zhì)組分鑒定。 目的：探索卵巢癌患者腹水來源exosome的蛋白質(zhì)組成，尋找其中可能對機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生重要效應(yīng)的組分，通過這些組分預(yù)

15、測exosome在卵巢癌患者腹水中出現(xiàn)的意義和可能發(fā)揮的作用。 方法：將腹水中分離并且經(jīng)過鑒定的exosome通過SDS-PAGE電泳使蛋白質(zhì)組分按照分子量大小分開，判斷從不同患者腹水分離得到的exosome在染色劑可分辨的水平(μg/ml)是否有差異。將exosome懸液進(jìn)行雙向電泳使得蛋白質(zhì)成分按照分子量和等電點(diǎn)的差異分開。將分離的蛋白質(zhì)點(diǎn)酶切消化后通過質(zhì)譜儀進(jìn)行鑒定。 結(jié)果：來自不同患者的exosome的蛋白質(zhì)條帶

16、在染色劑可分辨水平下沒有明顯的差異。雙向電泳能夠提高對exosome懸液中蛋白質(zhì)的分辨率。質(zhì)譜儀鑒定結(jié)果顯示，腹水來源的exosome懸液中豐度較高的蛋白是纖維蛋白(原)、白蛋白、免疫球蛋白、補(bǔ)體C3、血紅蛋白亞基，其他可能性較大的蛋白有HSP70、Ⅰ型和Ⅱ型碳酸酐酶、肌動蛋白、角蛋白、錨定蛋白、α-烯醇化酶。沒有鑒定出MHC分子和腫瘤相關(guān)抗原。 結(jié)論：不同患者腹水來源exoosome的蛋白質(zhì)條帶在常規(guī)染色水平?jīng)]有明顯的差異。e