葡萄根系產(chǎn)褪黑素內(nèi)生細(xì)菌的篩選及其合成路徑的研究.pdf

1、褪黑素(Melatonin，MEL)是一種動植物和單細(xì)胞生物中普遍具有的色氨酸衍生物，它擁有獨特的抗氧化和生理調(diào)節(jié)的功能。外源應(yīng)用MEL能夠促進(jìn)植物種子發(fā)芽，根系發(fā)育、開花以及果實成熟，同時也能防止葉片衰老，在生物和非生物逆境脅迫下提高植物的耐受能力。前人的研究表明，非生物脅迫能夠提高植物內(nèi)源MEL的合成，這是由于逆境脅迫下植物產(chǎn)生的活性氧類物質(zhì)(Reactive oxygen species;ROS)激活了植物MEL的生物合成。在自然

2、條件下，陸地植物的根系聚集著豐富的內(nèi)生微生物，它們能夠與宿主植物互相作用，并調(diào)節(jié)植物的生長和發(fā)育。內(nèi)生菌是植物生長發(fā)育的根系有益組分，它們往往具有合成植物激素的能力，并能夠改變宿主的內(nèi)源激素水平;然而，目前還沒有證據(jù)表明內(nèi)生菌能夠合成MEL，并且憑此能力，影響宿主植物的生理代謝。本研究從不同葡萄品種的根系內(nèi)分離、鑒定得到多種內(nèi)生細(xì)菌，隨后篩選出具有MEL合成能力的菌株。以高產(chǎn)MEL的菌株為材料，研究其對宿主植物逆境脅迫下內(nèi)源MEL水平和

3、生長發(fā)育的影響;通過15N穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)，探討內(nèi)生細(xì)菌MEL生物合成路徑;采用原核表達(dá)和基因敲除手段，驗證參與細(xì)菌MEL合成的L-苯丙氨酸羥化酶功能。主要研究結(jié)果如下:
　　(1)采用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)的方式并結(jié)合16S rDNA測序，從‘赤霞珠’，‘紅地球’，‘夏黑’以及中國野生山葡萄‘長白九號’根系中分離內(nèi)生細(xì)菌，并對優(yōu)勢菌進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)合UPLC-MS/MS技術(shù)測定菌株MEL的產(chǎn)生能力。結(jié)果顯示:4個葡萄品種根系中共分離得到內(nèi)生

4、細(xì)菌6個屬，15個種;檢測到5株細(xì)菌具有MEL合成能力，分別為Bacillus amyloliquefaciens SB-9,Bacillus thuringiensis CS-9,Pseudomonas fluorescens RG11,Agrobacterium tumefaciens CS-30和Variovorax soli VA10，MEL合成能力在0.15-7.75ng/1012cells之間。
　　(2)選取MEL合

5、成能力最強的內(nèi)生菌解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)SB-9和熒光假單胞桿菌(Pseudomonas fluorescens)RG11侵染不同葡萄品種幼苗根系，結(jié)果顯示，B.amyloliquefaciens SB-9和P.fluorescens RG11侵染葡萄幼苗顯著提高植株的鮮重，葉綠素含量，根長度和側(cè)根數(shù)量等生長指標(biāo)，表現(xiàn)出優(yōu)良的生長促進(jìn)作用;此外，在葡萄幼苗經(jīng)受干旱或者鹽脅迫時，B.amyl

6、oliquefaciens SB-9和P.fluorescens RG11根系定殖顯著提高內(nèi)源MEL及其前體物的含量，降低葡萄色氨酸脫羧酶基因（VvTDCs）和5-羥色胺N-乙酰轉(zhuǎn)移酶(VvSNAT)的轉(zhuǎn)錄水平;同時通過減少根系內(nèi)丙二醛(MDA)和活性氧的產(chǎn)生，抵御鹽和干旱脅迫帶來的不利影響。
　　(3)采用15N穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)，研究產(chǎn)MEL內(nèi)生細(xì)菌P.fluorescens RG11的MEL合成中間代謝產(chǎn)物組成以及合成規(guī)律。

7、結(jié)果顯示，除了15N-色胺以外，菌液中檢測到15N-5-羥色氨酸、15N-5-羥色胺、15N-N-乙酰-5-羥色胺以及15N-MEL的產(chǎn)生，表明此菌株MEL的合成途徑與動物中相似，MEL合成的第一步反應(yīng)是15N-L-色氨酸碳骨架被羥化形成5-羥色氨酸，推測細(xì)菌苯丙氨酸羥化酶(PAH)可能負(fù)責(zé)此菌株的色氨酸的羥基化;此外，P.fluorescens RG11的MEL合成能力在生長期前期最高，培養(yǎng)后期急劇下降，推測MEL在細(xì)菌中可能是作為生

8、長信號因子或作為保護(hù)因子用于清除培養(yǎng)基中的ROS，以促進(jìn)細(xì)菌生長早期的適應(yīng)性。
　　(4)分析原核細(xì)菌苯丙氨酸羥化酶(PAH)與動物氨基酸羥化酶（AAAHs）家族的親緣關(guān)系，同時克隆得到P.fluorescens RG11的PAH編碼基因，原核表達(dá)得到此菌株的PAH蛋白，通過酶活分析，在體外迸一步研究PAH對L-色氨酸的羥化能力，結(jié)果顯示:P.fluorescens RG11中PAH蛋白與動物AAAHs家族蛋白存在較高的氨基酸序列

9、相似性;體外酶活測試表明，純化的重組PAH蛋白同時具有L-色氨酸和L-苯丙氨酸羥化酶活性，能夠?qū)-色氨酸羥基化為5-羥基色氨酸，Km和Vmax值分別為2575μM和0.834μmol5-羥基色氨酸/min/mg蛋白，然而對L-色氨酸的親和力和羥化活力明顯低于羥化L-苯丙氨酸。
　　(5)通過同源重組技術(shù)，將P.fluorescens RG11控制合成PAH蛋白的phhA基因敲除，構(gòu)建ΔPhhA敲除菌株，隨后采用15N同位素示蹤法