棗內(nèi)生細(xì)菌種群多樣性和內(nèi)生拮抗細(xì)菌篩選的研究.pdf

1、本研究以河北省不同棗品種為研究對(duì)象，采用微生物傳統(tǒng)分離培養(yǎng)的方法、分子生物學(xué)技術(shù)、生理生化測(cè)定方法研究了棗內(nèi)生細(xì)菌的遺傳多樣性、分布狀態(tài)多樣性及其動(dòng)態(tài)分析，首次系統(tǒng)地對(duì)婆棗內(nèi)生細(xì)菌的多樣性及種群結(jié)構(gòu)分布狀態(tài)進(jìn)行了研究，對(duì)婆棗縮果?。ㄒ喾Q棗鐵皮?。┎〗≈甑膬?nèi)生細(xì)菌進(jìn)行了比較，并分離篩選出對(duì)縮果病原菌及植物常見(jiàn)病原菌有拮抗作用的內(nèi)生細(xì)菌。主要獲得以下研究成果:
　　1.對(duì)棗樹(shù)的根、枝條、葉片和果實(shí)表面最佳滅菌條件進(jìn)行了研究，確定出最佳

2、滅菌條件:先用75％乙醇浸泡3min，然后葉片用3.0％次氯酸鈉溶液處理3 min，枝條用2.5％次氯酸鈉溶液處理4 min，根用2.5％次氯酸鈉溶液處理4 min，果實(shí)則用2.5％次氯酸鈉溶液處理3 min，再用75％乙醇浸泡30 s，最后用無(wú)菌水沖洗。
　　通過(guò)對(duì)10種培養(yǎng)基的篩選，確定出了適宜的培養(yǎng)基，即采用TSA培養(yǎng)基、KMB和NA培養(yǎng)基組合進(jìn)行培養(yǎng)，分離出內(nèi)生細(xì)菌的種群數(shù)量和菌落種類較多。
　　2.對(duì)河北省5地區(qū)的

3、不同棗品種及其不同組織器官的內(nèi)生細(xì)菌的種類和數(shù)量進(jìn)行分離分析，結(jié)果表明在棗的不同器官組織中均能分離到內(nèi)生細(xì)菌，在不同地區(qū)、不同棗樹(shù)品種以及植株的不同器官組織中芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)和假單胞桿菌屬（Pseudomonas sp.）均有分布，且二者為優(yōu)勢(shì)種群;從組織中分離出的內(nèi)生細(xì)菌種類和數(shù)量因地區(qū)、品種、器官、生育期不同而異。不同器官內(nèi)生細(xì)菌的種類基本遵循根部最多，其次是葉片和果實(shí)，枝條最少的規(guī)律;內(nèi)生細(xì)菌的數(shù)量則為根部最

4、多，其次為葉片和枝條，果實(shí)中最少。共分離出內(nèi)生細(xì)菌13個(gè)屬，16個(gè)種，分別為芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)、假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter sp.)等屬，其中首次從棗植株內(nèi)分離到濕斯捷連科屬Nesterenkonia、寡養(yǎng)單胞菌屬Stenotrophomonas土地桿菌Pedobacter，Gamma proteobacterium等10個(gè)屬。
　　3.本試驗(yàn)對(duì)婆棗內(nèi)生細(xì)菌

5、進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究，結(jié)果表明，婆棗植株內(nèi)有大量種群豐富的內(nèi)生細(xì)菌，根部和枝條內(nèi)生細(xì)菌種群數(shù)量和密度均高于葉片組織。分離出的212株內(nèi)生細(xì)菌分別屬于芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)、假單胞菌屬(Pseudomonassp.)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter sp.)和葡萄球菌屬(Staphylococcus sp.)等11個(gè)已知屬，其中優(yōu)勢(shì)菌種類為芽孢桿菌屬，優(yōu)勢(shì)種群在棗組織內(nèi)均有分布，但在根部、枝條和葉片中所占比例不同。物候

6、期不同，植株體內(nèi)內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量和種類有所不同，從休眠期到盛花期，內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量、種類逐漸增多，從盛花期、幼果期到果實(shí)生長(zhǎng)中后期，內(nèi)生細(xì)菌的數(shù)量和種類逐漸減少，它們之間的差異達(dá)到了極顯著水平;不同器官內(nèi)生細(xì)菌的分離幾率也不相同，從高到低的次序?yàn)楦?、枝條、葉片、果實(shí)，根部分離出的菌落種類最多，高達(dá)15種。
　　4.對(duì)婆棗縮果病株和健株內(nèi)生細(xì)菌的分離結(jié)果表明，病株葉片和枝條中所分離的內(nèi)生菌種類少于健株，而內(nèi)生菌數(shù)量則大于健株;病株果實(shí)內(nèi)所分

7、離的內(nèi)生細(xì)菌種類和數(shù)量均小于健株?？s果病發(fā)病率、病情指數(shù)與芽孢桿菌屬細(xì)菌的含量之間呈負(fù)相關(guān)。內(nèi)生細(xì)菌在不同的組織器官之間存在顯著差異，而葉片與果實(shí)、枝條與果實(shí)、葉片與枝條之間關(guān)系不顯著;上、中、下不同位置葉片、枝條、果實(shí)之間的內(nèi)生細(xì)菌差異不顯著，而東、西、南、北不同方位葉片、枝條之間的內(nèi)生細(xì)菌含量差異顯著。分析多樣性指數(shù)表明SHANNON(H1)指數(shù)枝條最高，果實(shí)最低，SIMPSON(D)指數(shù)最大值出現(xiàn)在枝條，果實(shí)最低，Pielou(E

8、)指數(shù)葉片最高，枝條最低。
　　5.對(duì)從婆棗中分離的19個(gè)菌株做了體外抗菌試驗(yàn)，篩選出對(duì)供試菌有體外抗菌活性的菌株7株，占菌株總數(shù)的36.8％，其中PZ-4、PZ-5、PZ-7、PZ-12等4株對(duì)8株供試菌株均有拮抗作用，并對(duì)引起棗縮果病的細(xì)交鏈孢菌（Alternaria.Alternata）和莖點(diǎn)霉菌（Allantophomoides carotae）表現(xiàn)出較強(qiáng)抑菌活性，經(jīng)鑒定分別為芽孢桿菌屬Bacillus sp.、節(jié)桿菌屬A

9、rthrobacter假單胞桿菌屬Pseudom onas、濕斯捷連科屬Nesterenkonia。
　　6.通過(guò)對(duì)PZ-4菌株形態(tài)學(xué)、生理生化指標(biāo)及其分子特性的研究，鑒定該菌株為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。該菌株對(duì)棗縮果病病原菌（細(xì)交鏈孢菌Alternaria.alternata和莖點(diǎn)霉菌Allantophomoides carotae），禾谷鐮刀菌(Fusarium grami-nearum)、玉米大斑