晶Ⅳ型和晶Ⅰ型尼群地平片人體藥代動力學(xué)和生物等效性研究.pdf

1、目的:1.測定晶Ⅳ型和晶Ⅰ型尼群地平片的體外溶出度并評價制劑間溶出度的相似性，以考察晶型對溶出度的影響，為臨床研究提供理論依據(jù)。2.建立可靠的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS)用于測定人體生物等效性研究中的血漿樣品的尼群地平濃度。3.進(jìn)行晶Ⅳ型和晶Ⅰ型尼群地平片在健康志愿者體內(nèi)的藥代動力學(xué)和生物等效性研究，評價其吸收、分布、代謝、排泄規(guī)律及生物利用度的差異，為新藥報批及進(jìn)一步的臨床研究與應(yīng)用提供理論支持。4.進(jìn)行CYP3A5基因多

2、態(tài)性對尼群地平藥代動力學(xué)的影響研究，尋找個體間藥動學(xué)差異的原因，為臨床個體化用藥提供參考依據(jù)。
　　方法:1.以900mL0.5％十二烷基硫酸鈉(SDS)溶液為溶出介質(zhì)，溫度為（37±0.5）℃，轉(zhuǎn)速為100r/min，取晶Ⅳ型尼群地平片和兩種晶Ⅰ型尼群地平片各六片，照溶出度測定第二法（槳法）依法操作，分別于5、15、30、45、60、90、120、180、240、360min時取溶液5mL，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾取續(xù)濾液，采

3、用新建立的經(jīng)方法學(xué)驗證的HPLC法測定晶Ⅳ型尼群地平片和兩種晶Ⅰ型尼群地平片的體外溶出度，并采用相似因子f2法評價制劑間溶出度的相似性。
　　2.建立HPLC-MS法測定人血漿中尼群地平濃度，色譜柱為Inertsil(@) ODS-3(4.6×150 mm，5μm);流動相為乙腈:5mM乙酸銨(70∶30，V/V);流速為0.8 mL/min;柱溫為25℃;進(jìn)樣量為10μL。質(zhì)譜條件為:ESI離子源，負(fù)離子檢測模式;選擇離子監(jiān)測(

4、SIM)質(zhì)荷比(m/z)359.1（尼群地平）和345.1（內(nèi)標(biāo):硝苯地平）;碎片電壓分別為100V和80V;毛細(xì)管電壓為3500V;干燥氣溫度為350℃;干燥氣(N2)流速為11.0 L/min。采用液液萃取法處理尼群地平血漿樣品后進(jìn)行方法學(xué)驗證。
　　3.以晶Ⅳ型尼群地平片為試驗制劑(T)，以兩種市售晶Ⅰ型尼群地平片為參比制劑(R1、R2)，采用三周期三交叉二重3×3拉丁方試驗設(shè)計。24名健康男性受試者單劑量口服試驗制劑或參比

5、制劑2片(10mg/片)，并于給藥前(0h)和給藥后0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、5.0、6.0、8.0、12.0、24.0h采集肘靜脈血6ml，肝素抗凝，5000rpm離心5 min，分離血漿。采用上述HPLC-MS法測定尼群地平血漿濃度。尼群地平血藥濃度-時間數(shù)據(jù)經(jīng)DAS2.1.1藥代動力學(xué)軟件處理，求出三種尼群地平片的藥代動力學(xué)參數(shù)，根據(jù)試驗制劑和參比制劑AUC0-24h的比值求出相對生物利用度;

6、對主要藥代動力學(xué)參數(shù)進(jìn)行方差分析、雙單側(cè)t檢驗和90％置信區(qū)間分析，評價試驗制劑和參比制劑的生物等效性。
　　4.采集受試者外周靜脈血2ml，EDTA抗凝，采用血液DNA提取試劑盒提取血樣DNA。將提取的24名受試者的DNA溶液分別加至CYP3A5基因檢測試劑盒后，采用熒光原位雜交儀檢測各受試者的CYP3A5基因型。依據(jù)CYP3A5基因分型結(jié)果，將相同基因型的受試者列為一組，在上述人體生物等效性研究的基礎(chǔ)上計算各組的平均藥代動力學(xué)

7、參數(shù)。采用SPSS17.0軟件中的獨(dú)立樣本t檢驗進(jìn)行計量資料兩組間的差異統(tǒng)計分析，P＜0.05認(rèn)為差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。考慮晶型對生物利用度的影響，所以單獨(dú)考察CYP3A5基因多態(tài)性對晶Ⅰ型和晶Ⅳ型尼群地平片人體藥代動力學(xué)的影響。
　　結(jié)果:1.晶Ⅳ型尼群地平片(A)與兩種晶Ⅰ型尼群地平片(B、C)體外溶出度的f2值分別為21.30和19.64，f2值＜50表明晶Ⅳ型尼群地平片與兩種晶Ⅰ型尼群地平片的體外溶出度均不相似;相同時間

8、點前者的溶出速率和溶出程度較后兩者高的多，表明晶Ⅳ型尼群地平片體外溶出度較兩種晶Ⅰ型尼群地平片明顯提高。兩種晶Ⅰ型尼群地平片溶出度的f2值為72.85，f2值＞50表明兩種片劑體外溶出度相似。
　　2.經(jīng)方法學(xué)驗證，血漿中內(nèi)源性雜質(zhì)不干擾尼群地平和內(nèi)標(biāo)硝苯地平的測定，建立的HPLC-MS法專屬性強(qiáng)。尼群地平血漿濃度在0.2～40ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r2＞0.99)，最低定量限可達(dá)0.2ng/mL。低、中、高（0.5、5和

9、35ng/mL）濃度點的日內(nèi)、日間相對標(biāo)準(zhǔn)差均在±15％之內(nèi)，方法的精密度和準(zhǔn)確度良好。尼群地平提取回收率約為70％，基質(zhì)效應(yīng)為96.89～101.38％，表明血漿基質(zhì)對尼群地平血漿濃度測定無影響。尼群地平血漿樣品提取后室溫放置16h、-20℃冷凍放置1、7、14、28、56天及凍融一次和凍融兩次的穩(wěn)定性均符合要求。建立的HPLC-MS法靈敏準(zhǔn)確，適用于人體生物等效性研究中的尼群地平血漿樣品的批量分析。
　　3.晶Ⅳ型尼群地平片(

10、T)與兩種晶Ⅰ型尼群地平片(R1、R2)的主要藥代動力學(xué)參數(shù)如下，t1/2分別為(5.075±2.430)h、(3.031±2.264)h和(3.468±1.916)h;Tmax分別為(2.625±0.516)h、(2.188±0.640)h和(2.083±0.761)h;Cmax分別為(10.759±7.809)ng·mL-1、(3.291±2.300) ng·mL-1和(3.437±2.240) ng·mL-1; AUC0～24h分

11、別為(46.354±39.409) ng·mL-1·h、(13.316±13.271) ng·mL-1·h和(13.326±9.994) ng·mL-1·h,AUC0～∞分別為(49.394±41.909) ng·mL-1·h、(14.802±14.249) ng·mL-1·h和(14.807±11.195) ng·mL-1·h。晶T型尼群地平片R1與R2的AUC0～24的比值為100.08％。晶Ⅳ型尼群地平片相對晶Ⅰ型尼群地平片R1、

12、R2的生物利用度(F)分別為348.11％和347.84％。晶Ⅳ型尼群地平片與晶Ⅰ型尼群地平片R1、R2的經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換的Cmax比值的90％置信區(qū)間均未落在80％～125％范圍內(nèi)，經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換的AUC0～24h比值的90％置信區(qū)間均未落在80％～125％范圍內(nèi)，表明晶Ⅳ型尼群地平片與晶Ⅰ型尼群地平片R1、R2均生物不等效，并且前者的口服吸收和生物利用度較后兩者明顯提高。
　　4.24名受試者CYP3A5基因型結(jié)果如下，CYP3A5*1

13、/*1（野生型）為10名，CYP3A5*1/*3（突變雜合型）為10名，CYP3A5*3/*3（突變純合型）為4名。
　　對于晶Ⅳ型尼群地平片，CYP3A5*1/*1、CYP3A5*1/*3和CYP3A*3/*3各組對應(yīng)的平均藥代動力學(xué)參數(shù)如下，t1/2分別為4.909 h、4.796 h、6.1905 h;Tmax分別為2.500 h、2.650 h、2.875 h;Cmax分別為8.250 ng·mL-1、11.337 ng·

14、mL-1、15.587ng·mL-1; AUC0～24分別為35.835 ng·mL-1·h、48.202 ng·mL-1·h、68.033 ng·mL-1·h;AUC0～∞分別為37.957 ng·mL-1·h、51.132 ng·mL-1·h、73.639 ng·mL-1·h。CYP3A5*3/*3與CYP3A5*1/*1、CYP3A5*1/*3相比，Cmax有增大趨勢但均未形成顯著性差異(P=0.139、0.449);同樣，AUC

15、0～24h有增大趨勢但也均未形成顯著性差異(P=0.152、0.511)。三種基因型的AUC0～∞、t1/2和Tmax無顯著性差異(P＞0.05)。
　　對于晶Ⅰ型尼群地平片，CYP3A5*1/*1、CYP3A5*1/*3和CYP3A5*3/*3各組對應(yīng)的平均藥代動力學(xué)參數(shù)如下:t1/2分別為3.126 h、3.648 h、2.561 h;Tmax分別為2.100 h、2.150 h、2.188 h;Cmax分別為3.399 ng

16、·mL-1、3.452 ng·mL-1、3.057 ng·mL-1;AUC0～24h分別為11.925 ng·mL-1·h、15.999 ng·mL-1·h、10.116 ng·mL-1·h; AUC0～∞分別為13.066 ng·mL-1·h、18.036 ng·mL-1·h、11.075 ng·mL-1·h。與晶Ⅳ型尼群地平片不同，CYP3A5*1/*1、CYP3A5*1/*3及CYP3A5*3/*3的Cmax、AUC0～24h和A

17、UC0～∞并未表現(xiàn)出明顯的增大趨勢，統(tǒng)計分析均無顯著性差異(P＞0.05);三種基因型的t1/2和Tmax無顯著性差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論:1.晶Ⅳ型尼群地平片的體外溶出度明顯高于兩種晶Ⅰ型尼群地平片的體外溶出度;提示，晶型對尼群地平片的溶出產(chǎn)生顯著影響。
　　2.晶Ⅳ型尼群地平片與兩種晶Ⅰ型尼群地平片為生物不等效制劑，藥代動力學(xué)參數(shù)存在顯著差異，晶Ⅳ型尼群地平片的口服吸收和生物利用度均明顯高于晶Ⅰ型尼群地平片;提示