基于幾種色譜分析方法的生物樣本的代謝組學(xué)研究.pdf

1、代謝組學(xué)又稱代謝物組學(xué),是研究機(jī)體代謝產(chǎn)物譜變化的一種新的系統(tǒng)方法。作為一種“組學(xué)”科學(xué),它借助高通量、高靈敏度與高精確度的現(xiàn)代分析技術(shù),分析細(xì)胞、組織和其它生物樣本如血液或尿液中內(nèi)源性代謝物整體組成(Metabolome)并通過其復(fù)雜的、動(dòng)態(tài)的變化來辯識(shí)和解析被研究對(duì)象的生理病理狀態(tài)。代謝物組是蛋白質(zhì)組、轉(zhuǎn)錄組和基因組總體表達(dá)的結(jié)果,直接反映組織的生化狀態(tài),能夠較靈敏地刻畫生命體生理病理狀態(tài)的變化,對(duì)于闡明生命復(fù)雜系統(tǒng)具有極為重要的意

2、義。其最主要的特征就是高通量的實(shí)驗(yàn)和大規(guī)模的計(jì)算,從系統(tǒng)生物學(xué)的角度出發(fā),全面地綜合地考察代謝變化。作為嶄新的方法學(xué),代謝組學(xué)已成為國際上疾病與健康研究的一個(gè)重要熱點(diǎn)。因此用代謝組學(xué)的方法來研究復(fù)雜疾病包括代謝性疾病(如肥胖),對(duì)于疾病的早期診斷、預(yù)防、藥物干預(yù)具有重要的指導(dǎo)意義,而代謝組學(xué)研究必須要有高通量、高靈敏度與高精確度的分析技術(shù)來支撐,對(duì)獲得的樣品中所有代謝物進(jìn)行分析鑒定是代謝組學(xué)研究的重要步驟,也是變化最復(fù)雜最難控制從而導(dǎo)致

3、分析結(jié)果難以重現(xiàn)的關(guān)鍵所在。與原有的各種組學(xué)技術(shù)只分析特定類型的物質(zhì)不同,代謝組學(xué)分析對(duì)象的大小、數(shù)量、官能團(tuán)、揮發(fā)性、帶電性、電遷移率、極性以及其他物理化學(xué)參數(shù)差異很大,必須要對(duì)它們進(jìn)行無偏向的全面分析,采用傳統(tǒng)的分析方法依靠單一待定組分的已知性質(zhì)獲取信息,有以下局限性：(Ⅰ)樣品處理方法復(fù)雜耗費(fèi)人力；(Ⅱ)步驟多,方法多特異性,每種只適用于幾種組分；(Ⅲ)代謝物降解造成假相,重現(xiàn)性差；(Ⅳ)不能滿足樣品的通過速率；(Ⅴ)不能測(cè)出協(xié)同

4、效應(yīng)。核磁共振(NMR)較早地被運(yùn)用到代謝組學(xué)研究,但是NMR的缺點(diǎn)是靈敏度較低,有可能形成信號(hào)重疊,且其對(duì)樣品制備的要求很高,在發(fā)展成為高通量的分析方法時(shí),受到局限。同時(shí)因?yàn)閯?dòng)態(tài)范圍有限,很難同時(shí)測(cè)定生物體系中共存的濃度相差較大的代謝產(chǎn)物。由于體液中所含組分眾多,得到的核磁譜圖往往很復(fù)雜,單獨(dú)采用NMR很難對(duì)復(fù)雜的產(chǎn)物組分進(jìn)行指認(rèn),因此,需要將NMR分析手段與其他各種色譜技術(shù)進(jìn)行聯(lián)用,方能成為藥物代謝物組學(xué)研究的強(qiáng)大的手段。同時(shí)其靈敏

5、度比MS差,所需進(jìn)樣量相對(duì)較大,因此體液中的很多痕量組分往往可能檢測(cè)不到,而色譜是最常用和有效的分離分析工具,其與質(zhì)譜的聯(lián)用則可以完成從成分分離到鑒定的一整套工作。因此建立適用于代謝組學(xué)研究的色譜分離分析方法具有可行性和迫切性。本文從生物樣本的前處理方法入手,確定了切實(shí)可行的樣本前處理方法,通過一系列方法學(xué)研究建立適用于代謝組學(xué)研究的GC/MS、LC/MS和pCEC分離分析技術(shù),以尿液為研究對(duì)象,進(jìn)行代謝組學(xué)分析,結(jié)合PCA,PLS-D

6、A,OPLS-DA等模式識(shí)別技術(shù)解決大量色譜峰的識(shí)別和代謝變化的趨勢(shì)分析,同時(shí)將該方法用于檢測(cè)高脂飼料誘導(dǎo)的肥胖大鼠自身代謝的變化,考察本論文建立方法的適用性和準(zhǔn)確性,得到了重現(xiàn)性好、穩(wěn)定、特征性顯著的代謝組學(xué)圖譜,為進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。研究結(jié)果如下：1.建立了生物樣本的前處理方法。在生物樣本(本文主要是指尿液)中影響最大的是蛋白質(zhì),若用色譜法測(cè)定時(shí),蛋白質(zhì)會(huì)沉積在色譜柱上發(fā)生堵塞,嚴(yán)重影響分離效果。本文通過實(shí)驗(yàn)篩選建立了尿液的前處理

7、方法。首先將尿液在14000rpm下離心沉淀蛋白、濃縮富集直接用于LC/MS的測(cè)定,離心之后所得上清液用衍生化試劑氯甲酸乙酯(ECF)衍生,直接進(jìn)行GC/MS和pCEC分析。結(jié)果表明,建立的尿液前處理方法簡(jiǎn)單、方便,適合大批量尿液的處理。2.建立了適合代謝組學(xué)研究的GC/MS測(cè)定方法。首先通過實(shí)驗(yàn)確定了尿液樣品的處理方法及測(cè)試條件(包括尿液樣本的各種不同處理方法的篩選,衍生化處理過程中尿液樣本用量的選擇、衍生化試劑的選擇、前處理方法中催

8、化劑的選擇、衍生化條件的選擇、GC/MS升溫程序的優(yōu)化等),建立了用于代謝組學(xué)研究的GC/MS測(cè)定方法,方法學(xué)研究表明建立的方法重復(fù)性好、靈敏度高,精確度高,適用于快速的高通量檢測(cè)。采用建立的GC/MS方法測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組與高脂飼料誘導(dǎo)大鼠的尿液。采用優(yōu)化的方法,檢測(cè)到了約200~250個(gè)尿樣代謝物,通過譜庫檢索和采用標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)確定了其中的80多個(gè)代謝物。得到的原始數(shù)據(jù)首先經(jīng)過XCMS軟件處理,利用Matlab software 7

9、.0和SIMCA-P11.0等統(tǒng)計(jì)軟件而建立的多維數(shù)據(jù)處理和計(jì)算方法,進(jìn)行PCA分析,通過PCA得分圖可以清楚地區(qū)分開對(duì)照組大鼠與高脂飼料誘導(dǎo)大鼠的代謝物的區(qū)別,說明用代謝組學(xué)方法可以區(qū)分出兩種不同飲食動(dòng)物的代謝物譜差異。采用OPLS-DA進(jìn)行進(jìn)一步的數(shù)據(jù)處理,由OPLS-DA分析結(jié)果可以直觀的看出尿液中內(nèi)源性代謝物含量發(fā)生的變化,尿液中代謝物的升高或降低揭示了與此相關(guān)的代謝途徑發(fā)生的變化。3.首次將pCEC技術(shù)應(yīng)用到代謝組學(xué)研究中,建

10、立了適合于代謝組學(xué)研究的pCEC測(cè)定方法。通過實(shí)驗(yàn)確定了尿液樣品的處理方法及測(cè)試條件(包括尿液樣本用量的選擇、衍生化試劑的選擇、前處理方法中催化劑的選擇、衍生化條件的選擇、以及pCEC測(cè)試條件如檢測(cè)波長(zhǎng)、酸溶液種類、酸改性劑濃度、流動(dòng)相組成、操作電壓、梯度洗脫條件的優(yōu)化等),建立了用于代謝組學(xué)研究的pCEC測(cè)定方法,方法學(xué)研究表明建立的方法重復(fù)性好、靈敏度高,適用于快速的高通量檢測(cè)。采用建立的pCEC方法分析了不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組大鼠與高脂

11、飼料誘導(dǎo)大鼠的代謝特征。采用優(yōu)化的方法,檢測(cè)到了約100個(gè)尿樣代謝物,通過標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)確定了其中變化差異明顯的8個(gè)代謝物。從pCEC圖譜就可以直觀的看出對(duì)照組大鼠與喂食高脂飼料肥胖大鼠代謝物發(fā)生了顯著的變化(包括8個(gè)確定的代謝物與7個(gè)沒有定性的代謝物),得到的原始數(shù)據(jù)首先經(jīng)過XCMS軟件處理,利用Matlab software 7.0和SIMCA-P11.0等統(tǒng)計(jì)軟件而建立的多維數(shù)據(jù)處理和計(jì)算方法,進(jìn)行PCA分析,通過PCA得分圖可以更清

12、楚地區(qū)分開對(duì)照組大鼠與高脂飼料誘導(dǎo)大鼠的代謝物的區(qū)別,說明用代謝組學(xué)方法可以區(qū)分出不同飲食條件下動(dòng)物的代謝物譜差異。采用OPLS-DA進(jìn)行進(jìn)一步的數(shù)據(jù)處理,由OPLS-DA分析結(jié)果可以直觀的看出尿液中內(nèi)源性代謝物含量發(fā)生的變化,尿液中代謝物的升高或降低揭示了與此相關(guān)的代謝途徑發(fā)生的變化。4.建立了適合代謝組學(xué)研究的LC/MS測(cè)定方法。首先通過實(shí)驗(yàn)確定了尿液樣品的處理方法及測(cè)試條件,在14000rpm下高速離心,直接進(jìn)樣分析,色譜條件：色

13、譜柱：Agilent Eclipse XDB-C8 5μm,4.6mm×150mm；流速：0.8ml/min；柱溫：40℃；流動(dòng)相：乙腈-0.2%HAC水溶液梯度洗脫；UV：254nm；MS：APCI+ESI混合離子化模式,72~1000范圍內(nèi)正離子全掃描模式；氣流10.0L/min；溫度：350℃；噴霧溫度：250℃；毛細(xì)管電壓：2000V,建立了用于代謝組學(xué)研究的LC/MS測(cè)定方法,方法學(xué)研究表明建立的方法重復(fù)性好、靈敏度高,適用于

14、快速的高通量檢測(cè)。同時(shí)采用建立的LC/MS方法分析了不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組與高脂飼料誘導(dǎo)大鼠的代謝特征。采用優(yōu)化的方法,檢測(cè)到了約100個(gè)尿樣代謝物,通過提取離子與標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)確定了其中的20多個(gè)代謝物。得到的原始數(shù)據(jù)首先經(jīng)過XCMS軟件處理,利用Matlab software 7.0和SIMCA-P11.0等統(tǒng)計(jì)軟件而建立的多維數(shù)據(jù)處理和計(jì)算方法,進(jìn)行PCA分析,PCA分析能夠揭示出對(duì)照組大鼠與高脂飼料誘導(dǎo)肥胖大鼠的總體代謝物的差異；為了找出

15、發(fā)生變化的重要的內(nèi)源性代謝物,我們采用了一種新型的監(jiān)督性算法OPLS-DA。OPLS-DA回歸系數(shù)能夠直觀的表示出尿樣中重要代謝物的升高或者降低,從而研究關(guān)鍵代謝物通道的變化。5.對(duì)三種建立的色譜分析方法在代謝組學(xué)研究中的應(yīng)用進(jìn)行了比較。體內(nèi)代謝產(chǎn)物多而復(fù)雜,對(duì)某一物種、某個(gè)組織或其細(xì)胞中所有的代謝途徑中的所有代謝產(chǎn)物同時(shí)進(jìn)行全面的高通量的定性和定量分析,在理論上行得通。但目前沒有任何一個(gè)分析技術(shù)能夠同時(shí)對(duì)代謝組中的所有化合物進(jìn)行分析。