液相色譜分析方法的建立

1、一.方法建立的步驟方法建立的步驟二開(kāi)始前應(yīng)知道二開(kāi)始前應(yīng)知道1.樣品的性質(zhì)樣品的性質(zhì)在開(kāi)始方法建立之前，我們應(yīng)該檢查自己對(duì)樣品的了解程度，并明確分離在開(kāi)始方法建立之前，我們應(yīng)該檢查自己對(duì)樣品的了解程度，并明確分離目標(biāo)。目標(biāo)。表1有關(guān)樣品組分和性質(zhì)的重要信息有關(guān)樣品組分和性質(zhì)的重要信息所含化合物的數(shù)目化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)（官能團(tuán)）化合物的分子量化合物的pKa值化合物的UV光譜圖化合物在樣品中的濃度范圍樣品的溶解度樣品的化學(xué)成分能夠?yàn)檫x擇HPL

2、C分離的最佳初始條件提供有價(jià)值的線索根據(jù)已知的樣品信息，HPLC方法建立有兩種不甚相同的模式。一種模式依據(jù)樣品的“化學(xué)性質(zhì)”選擇最佳初始條件，色譜工作者需很大程度依賴于過(guò)去的經(jīng)驗(yàn)（如類似結(jié)構(gòu)化合物的分離）和或用文獻(xiàn)資料補(bǔ)充現(xiàn)有信息而另一種模式則直接開(kāi)始色譜分離，而對(duì)樣品的性質(zhì)不大注意這兩種HPLC的方法建立模式可分別稱為理淪型與經(jīng)驗(yàn)型初始分離一旦開(kāi)始，可以根據(jù)類似的思路（理論的與經(jīng)驗(yàn)的）選擇進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。2.分離的目的分離的目的HPLC

3、分離的目的必須十分明確，下面的問(wèn)題在建立方法之初就應(yīng)確定：（1）主要目的是什么？定量或定性，還是定性、定量同時(shí)做？；（2）是否有必要解析出樣品的所有成分？譬如可能有必要分離出產(chǎn)品中的所有降解物或雜質(zhì)，以使含量測(cè)定結(jié)果更加可靠，但卻沒(méi)必要將它們彼此完全分開(kāi)。（3）如要求定量分析，準(zhǔn)確度與精密度需多大？樣品主要成分的精密度通常能達(dá)到1—2%，特別是不需樣品預(yù)處理的情況。（4）特殊化合物可能會(huì)以不同的樣品形式出現(xiàn)（如：原料藥，一種或多種形態(tài)，

4、環(huán)保樣品等）。是否需要一種以上的HPLC方法？單一方法分離不同形態(tài)樣品是否理想？（5）一次將分析多少樣品？當(dāng)必須同時(shí)處理大量樣品時(shí)，運(yùn)行時(shí)間將變得非常重要。有時(shí)甚至為了縮短運(yùn)行時(shí)間而以犧牲樣品分離度作代價(jià)，如縮短柱長(zhǎng)或加快流速。當(dāng)一次分析的樣品數(shù)目超過(guò)10個(gè)，運(yùn)行時(shí)間一般應(yīng)控制在20min以內(nèi)。（6）將要使用該方法的實(shí)驗(yàn)室中，有哪些HPLC設(shè)備？色譜柱能否恒溫系統(tǒng)能否做梯度洗脫？該方法是否可在不同設(shè)計(jì)與生產(chǎn)的設(shè)備上運(yùn)行？方法建立實(shí)驗(yàn)開(kāi)始

5、之前，應(yīng)明確對(duì)方法的這些要求。方法建立實(shí)驗(yàn)開(kāi)始之前，應(yīng)明確對(duì)方法的這些要求。三.樣品的預(yù)處理和檢測(cè)樣品的預(yù)處理和檢測(cè)等度肽類糖類梯度大分子大分子蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)離子對(duì)離子對(duì)核酸糖類正相合成聚合物合成聚合物圖1.利用樣品的有關(guān)條件，選擇初始實(shí)驗(yàn)分離條件利用樣品的有關(guān)條件，選擇初始實(shí)驗(yàn)分離條件表2特殊樣品的處理特殊樣品的處理樣品要求無(wú)機(jī)離子檢測(cè)為主要問(wèn)題；使用離子色譜異構(gòu)體有些異構(gòu)體能用反相HPLC分開(kāi)，可分為一般樣品類中；用(I)正相HPLC

6、或(2)環(huán)糊精—硅膠色譜柱的反相分離能較好地分離異構(gòu)體對(duì)映體分離這些化合物需要“手性”條件生物樣品多種因素如分子構(gòu)象，極性官能團(tuán)和寬范圍的疏水性使這種樣品很特殊大分子“大”分子需要大孔徑的色譜柱填料(≥10.m孔徑)表3首次首次HPLC分離的較好實(shí)驗(yàn)條件分離的較好實(shí)驗(yàn)條件分離條件較好的首要選擇色譜柱色譜柱尺寸(長(zhǎng)度內(nèi)徑ID)粒度固定相15ⅹ4.6cn5uma.C8或C18流動(dòng)相流動(dòng)相溶劑A和B緩沖液—乙睛%B80—100%b.緩沖液(化

7、合物、pH、濃度)25mM磷酸鉀，2.0＜pH＜3.0c.添加劑(如胺改性劑、離子對(duì)試劑)開(kāi)始時(shí)不用流速流速0.5—2.0mlmin溫度溫度35—45℃樣品大小樣品大小體積重量d.＜25ul＜100ug備注：a.3.5um微粒為另一選擇；b.用于初始等度分離；初始用梯度實(shí)驗(yàn)較好；c.中性樣品不需要緩沖液；d.小體積色譜柱（如7.50.46cm3.5um）需要的量更小。表4主要主要HPLC方法的特性方法的特性方法特點(diǎn)色譜柱何時(shí)應(yīng)該使用該方