MFFP的構(gòu)建及其對(duì)T2DM及血栓并發(fā)癥模型小鼠的療效學(xué)研究.pdf

1、糖尿病(diabetes mellitus，DM)是胰島素絕對(duì)或相對(duì)分泌不足以及機(jī)體對(duì)胰島素敏感性降低所引起的代謝紊亂疾病。其主要臨床特征為血糖高、血脂高以及高粘血癥等，被稱為“百病之源”。隨著人們生活水平的提高，近年來糖尿病發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì)。因此，尋找更好的糖尿病治療藥物、給藥途徑和治療方法是學(xué)術(shù)界亟待解決的重要課題。糖尿病除了其本身的危害以外，往往還會(huì)帶來一系列的并發(fā)癥，這些并發(fā)癥給患者帶來了更為嚴(yán)重的后果。糖尿病患者死亡率最

2、高的為心腦血管病變，約占80％，其中血栓的發(fā)病率為非糖尿病人的12倍。因此，在糖尿病的治療中，找到一種治療糖尿病同時(shí)又能有效預(yù)防和治療心腦血管疾病血栓等并發(fā)癥的治療方法或藥物具有十分重要的意義。
　　胰高血糖素樣多肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)是由腸道L細(xì)胞合成和分泌的由30個(gè)氨基酸組成的多肽。GLP-1具有促進(jìn)葡萄糖依賴性胰島素分泌、減少食物攝取、減慢胃排空，以及抑制胰高血糖素分泌、刺激胰β

3、細(xì)胞增殖、促進(jìn)胰島再生、抑制胰β細(xì)胞的凋亡等特殊功能。葡萄糖依賴性促胰島素釋放激素（glucose-dependent insμlintropic polypeptide，GIP）是由腸道K細(xì)胞合成和分泌的由42個(gè)氨基酸組成的多肽。具有促進(jìn)第一時(shí)相胰島素的分泌，改善胰島素敏感性，刺激胰β細(xì)胞再生，延緩胰島素清除等作用，對(duì)2型糖尿病具有良好的治療效果。水蛭素(Hirudin，HV)是從醫(yī)蛭(Hirudomedieinalis)唾液腺中分離

4、的一種酸性小分子蛋白，是目前發(fā)現(xiàn)的最好的凝血酶抑制劑，在預(yù)防和治療人類心腦血管疾病方面有著非常顯著的療效，是治療心腦血管疾病的首選良藥。
　　本研究通過定點(diǎn)突變技術(shù)將天然GLP-1基因內(nèi)部的第8位的Ala替換成Ser，以抑制二肽酶Ⅳ(Dipeptidyl peptidaseⅣ, DPP-Ⅳ)對(duì)其降解，并分別將第26位的Glu和第34位的Asp替換成Lys抑制胰蛋白酶的切割，克隆了抗DPP-Ⅳ和胰蛋白酶切割的GLP-1同源物，命名為

5、重組口服長效GLP-1(recombinant orallong-acting GLP-1，rolGLP-1)。通過分子克隆手段將GIP第2位的Ala用Gly替換，獲得抗DPP-Ⅳ切割的重組GIP(recombinant glucose-dependentinsμlintropic polypeptide，rGIP)和重組HV(recombiant Hirudin，rHV)。將多拷貝的rolGLP-1基因分別與多拷貝的rGIP基因和單拷

6、貝的rHV基因串聯(lián)，分別獲得4rolGG(4rolGLP-4GIP)、5rolGLP-4GIP和5rolGLP-HV基因，將基因克隆到pET22b(+)載體后，分別獲得表達(dá)載體pET-22b(+)-rolGG、pET-22b(+)-4rolGG、pET-22b(+)-5rolGLP-4 GIP和pET-22b(+)-5rolGLP-HV,轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)。轉(zhuǎn)化的工程菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，經(jīng)SDS-PAGE電泳分析證明均

7、實(shí)現(xiàn)了這些融合多肽的高效可溶性表達(dá)。對(duì)其誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明:rolGG最佳表達(dá)條件為IPTG濃度為0.6mmol/L、溫度為30℃下培養(yǎng)10h;4rolGG最佳表達(dá)條件為在IPTG終濃度為0.2mmol/L，溫度在37℃下誘導(dǎo)5h;5rolGLP-4GIP最佳表達(dá)條件為在IPTG終濃度為0.4mmol/L，溫度在30℃下誘導(dǎo)10h;5rolGLP-HV最佳表達(dá)條件為IPTG終濃度為0.4mmol/L，溫度在37℃下誘導(dǎo)5h;

8、菌體裂解液經(jīng)超生破碎后，上清經(jīng)過Ni金屬親和層析進(jìn)行純化，分別獲得純度較高的rolGG、4rolGG、5rolGLP-4GIP和5rolGLP-HV融合多肽，為以后功能的驗(yàn)證奠定了良好基礎(chǔ)。
　　rolGG體外切割實(shí)驗(yàn)證明，rolGG在體外可以被修飾性胰蛋白酶切割成rolGLP-1和rGIP，切割率達(dá)到70％。
　　采用STZ誘導(dǎo)的2型糖尿病小鼠模型分別對(duì)rolGG、4rolGG、5rolGLP-4GIP和5rolGLP-H

9、V融合多肽的降血糖功能進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明:與0.9％ NaCl處理的陰性對(duì)照組小鼠相比，rolGG、4rolGG、5rolGLP-4GIP和5rolGLP-HV等融合多肽均可有效地降低血糖和甘油三脂、膽固醇的水平，并改善口服糖耐量，糖化血紅蛋白以及胰島素的分泌情況，并可有效改善糖尿病小鼠的多飲、多食和體重減輕等癥狀。
　　采用凝血酶滴定法檢測(cè)rolGLP-HV的抗凝活性，結(jié)果表明5rolGLP-HV的抗凝活性為105±1.7 A

10、TU/ml，證明5rolGLP-HV融合多肽具有HV的抗凝血功能。采用血栓模型對(duì)5rolGLP-HV融合多肽的抗血栓活性進(jìn)行了檢測(cè)。在昆明小鼠背部皮下注射角叉菜膠(50mg/kg)的同時(shí)給小鼠灌胃5rolGLP-HV融合多肽，觀察小鼠尾部出現(xiàn)血栓的時(shí)間及血栓的相對(duì)長度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，灌胃5rolGLP-HV融合多肽的小鼠出現(xiàn)血栓的時(shí)間比對(duì)照延遲致32h，相對(duì)長度從37.5％縮減到25％，說明口服5rolGLP-HV融合多肽確實(shí)可以起到抗血栓

11、作用。
　　本研究為功能互補(bǔ)型雙元促胰島素rolGG以及多拷貝功能互補(bǔ)型雙元促胰島素4rolGG和5rolGLP-4GIP口服融合多肽類藥物的研發(fā)提供了較完善的實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)，并為利用口服重組融合多肽來防治2型糖尿病的臨床研究和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。本研究結(jié)果亦表明，5rolGLP-HV融合具有明顯的治療和預(yù)防糖尿病及血栓的雙重功能，有望研發(fā)成為治療糖尿病和心腦血管病的雙功能口服藥物，為今后5rolGLP-HV融合多肽的臨床前應(yīng)用研究奠