顳葉癲癇相關(guān)突觸后致密物蛋白的篩選研究.pdf

1、研究背景和目的： 顳葉癲癇(TLE)是難治性癲癇的常見類型。目前認(rèn)為顳葉癲癇難治的重要原因是神經(jīng)環(huán)路重建以及興奮性異常的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)形成，但其機(jī)制欠清楚。因此，探索神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)興奮性異常的原因具有重要意義。業(yè)已證實(shí)，癲癇發(fā)病與興奮性谷氨酸能突觸傳遞效能增高密切相關(guān)，其機(jī)制涉及突觸前神經(jīng)遞質(zhì)的釋放增加、突觸間隙谷氨酸鹽代謝障礙、突觸后受體的敏感性增加3個方面。以往的研究多側(cè)重于突觸前和突觸間隙調(diào)節(jié)機(jī)制，而對突觸后調(diào)節(jié)機(jī)制研究不多。突觸后致

2、密物(PSD)作為興奮性突觸后膜的超級信號復(fù)合體，可調(diào)節(jié)突觸后受體的敏感性，改變神經(jīng)信號傳遞的下游效應(yīng)，勢必最終決定興奮性突觸的傳遞效能，這可能是癲癇神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)興奮性異常形成的核心所在，亟待深入探討。但PSD與癲癇的關(guān)系國內(nèi)外研究甚少，只見于數(shù)量有限的幾種PSD蛋白質(zhì)表達(dá)變化，迫需全面深入探討PSD蛋白與TLE發(fā)病的關(guān)系。 為更快、更深入、更全面地探討PSD蛋白質(zhì)在顳葉癲癇形成中的作用機(jī)制，本研究采用高通量、高敏感的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)

3、，構(gòu)建顳葉癲癇大鼠全腦組織PSD蛋白質(zhì)的雙向凝膠電泳圖譜，首次對顳葉癲癇相關(guān)PSD蛋白進(jìn)行篩選和鑒定，為深入研究PSD蛋白與癲癇的關(guān)系提供線索，為尋找TLE防治新靶點(diǎn)提供依據(jù)。 研究方法： 建立氯化鋰-匹羅卡品大鼠顳葉癲癇模型。實(shí)驗(yàn)分為三組，即TLE自發(fā)組(SRS)、TLE無自發(fā)組(NSRS)、正常對照組(Norm組)。采用蔗糖密度梯度離心聯(lián)合膜順序提取法分別提取三組大鼠全腦組織的PSD蛋白成分。利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對提取

4、的PSD蛋白進(jìn)行比較篩選，鑒定出TLE發(fā)作相關(guān)蛋白，并采用western免疫印跡法進(jìn)一步驗(yàn)證部分TLE相關(guān)PSD蛋白的表達(dá)情況。 研究結(jié)果： 1、氯化鋰-匹羅卡品大鼠顳葉癲癇模型：致癇成功率為91.4％，模型成功率為71.4％，死亡率為20％。 2、PSD純度的檢驗(yàn)：檢測發(fā)現(xiàn)突觸后標(biāo)志分子NR1和PSD-95在P2成分、突觸體和PSD蛋白三組成分中均呈免疫印跡陽性，而突觸前標(biāo)志分子SynPhy在PSD成分中呈陰性

5、。 3、PSD蛋白質(zhì)的雙向凝膠電泳：通過PDQuest軟件進(jìn)行比較分析，結(jié)果顯示：One-PSD圖譜約有286±25個蛋白質(zhì)點(diǎn)，Two-PSD圖譜有720±17個蛋白質(zhì)點(diǎn)，兩組比較有顯著差異性(P<0.01)。與對照組相比較，眥自發(fā)組(SRS)表達(dá)上調(diào)的有12個，表達(dá)下調(diào)的有58個；TLE無自發(fā)組(NSRS)表達(dá)上調(diào)的有15個，表達(dá)下調(diào)的有38個。與TLE無自發(fā)組比較，TLE自發(fā)組表達(dá)上調(diào)的蛋白點(diǎn)有15個，表達(dá)下調(diào)的有25個。其

6、中發(fā)現(xiàn)僅在眥自發(fā)組特異表達(dá)的有4個。 4、部分差異PSD蛋白點(diǎn)的質(zhì)譜分析：鑒定的26個差異蛋白質(zhì)點(diǎn)根據(jù)功能可分為6類：①細(xì)胞骨架蛋白：微管蛋白tubulin alpha和tubulin beta，internexin-alpha，actin；②運(yùn)輸?shù)鞍祝篠orting Nexin 3(SNX3)；③能量代謝相關(guān)酶蛋白：肌酸激酶(CK)，果糖二磷酸醛縮酶(FBA)，甘油醛三磷酸脫氫酶(GAPDH)，琥珀酸輔酶A連接酶(SCOL)，

7、烏頭酸水合酶(ACO)；④分子伴侶：熱休克蛋白-27(HSP-27)；肽酰脯胺酸順反異構(gòu)酶(PPIase)；⑤信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子：甲狀腺素受體相互作用蛋白6(TRIP6)；⑥其它：髓鞘堿性蛋白S(myelin basic protein S,MBP)，LIM結(jié)構(gòu)域(LIM domain)。 5、Western驗(yàn)證結(jié)果與蛋白質(zhì)組學(xué)分析和鑒定基本一致，HSP27、SNX3、tubulin-alpha三種蛋白質(zhì)均在PSD中呈免疫陽性，且它們

8、在SRS、NSRS和Norm三組中的表達(dá)強(qiáng)度呈現(xiàn)出遞增或遞減現(xiàn)象，即HSP27:SRS>NSRS>Norm；tubulin-alpha：SRS