難治性癲癇突觸囊泡功能相關(guān)蛋白初步研究.pdf

1、目的：檢測(cè)耐苯妥英鈉杏仁核點(diǎn)燃大鼠腦組織突觸囊泡功能相關(guān)蛋白差異表達(dá)基因、與突觸囊泡回收相關(guān)的蛋白表達(dá)，以探討難治性癲癇突觸功能的改變，進(jìn)一步完善人類對(duì)難治性癲癇的認(rèn)識(shí)。 方法：建立耐苯妥英鈉杏仁核點(diǎn)燃大鼠(難治性癲癇鼠／耐PHT組/I組)和苯妥英鈉有效杏仁核點(diǎn)燃大鼠(非難治性癲癇鼠/PHT有效組/P組)模型，抽提兩者腦組織的RNA，并純化mRNA，分別逆轉(zhuǎn)錄合成熒光分子摻入的cDNA-鏈做探針；將含有4096條人類基因PCR產(chǎn)

2、物按微矩陣點(diǎn)樣于化學(xué)涂層的栽玻片上，制成基因芯片，芯片雜交和洗片后，用ScanArray300O熒光掃描儀掃描芯片熒光信號(hào)圖象，利用計(jì)算機(jī)分析耐PHT組和PHT有效組大鼠腦組織差異表達(dá)的突觸囊泡功能相關(guān)蛋白基因；篩選出部分與突觸囊泡循環(huán)回收相關(guān)的蛋白差異表達(dá)基因，運(yùn)用蛋白印跡法、免疫組化法在蛋白水平進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證。 結(jié)果：在4096條基因中，耐PHT組和PHT有效組大鼠腦組織間存在明顯差異表達(dá)的基因共364條，與突觸囊泡功能相關(guān)

3、蛋白差異表達(dá)基因18條，上調(diào)的有14條，下調(diào)的有4條，其中與突觸囊泡循環(huán)再生密切相關(guān)的網(wǎng)格蛋(clathrin)、突觸囊泡膜蛋白I(syn印totagminI)基因表達(dá)增強(qiáng)，而熱休克同源蛋白Hsc70假基因表達(dá)降低；運(yùn)用蛋白印跡、免疫組化對(duì)這3種蛋白產(chǎn)物進(jìn)一步驗(yàn)證顯示在難治性癲癇鼠腦組織與突觸囊泡循環(huán)再生密切相關(guān)的網(wǎng)格蛋白、突觸囊泡膜蛋白I表達(dá)增強(qiáng)，熱休克同源蛋白Hsc70表達(dá)降低(P

4、在突觸囊泡功能相關(guān)蛋白、基因差異表達(dá)，其中與突觸囊泡循環(huán)再生密切相關(guān)的網(wǎng)格蛋白、突觸囊泡膜蛋白I表達(dá)增強(qiáng)，熱休克同源蛋白Hsc70表達(dá)降低，提示難治性癲癇鼠腦組織可能存在突觸囊泡功能及循環(huán)再生的改變，這些改變?cè)陔y治性癲癇的發(fā)病及維持中可能起一定的作用。 目的：在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)陽性結(jié)果的基礎(chǔ)上進(jìn)一步檢測(cè)難治性癲癇病人腦組織突觸囊泡功能相關(guān)蛋白、基因的差異表達(dá)，以探討人類難治性癲癇突觸功能的改變，進(jìn)一步完善對(duì)人類難治性癲癇的認(rèn)識(shí)。

5、 方法：收集難治性癲癇病人和正常人腦組織標(biāo)本，抽提兩者腦組織的RNA，并純化mRNA，分別逆轉(zhuǎn)錄合成熒光分子摻入的cDNA-鏈做探針；將含有4096條人類基因PCR產(chǎn)物按微矩陣點(diǎn)樣于化學(xué)涂層的栽玻片上，制成基因芯片，芯片雜交和洗片后，用ScanArray4000熒光掃描儀掃描芯片熒光信號(hào)圖象，利用計(jì)算機(jī)分析難治性癲癇病人和正常對(duì)照組腦組織差異表達(dá)的突觸囊泡功能相關(guān)蛋白基因；篩選出部分突觸囊泡循環(huán)回收相關(guān)蛋白差異表達(dá)基因，運(yùn)用RT-PCR

6、、免疫組化在mRNA及蛋白水平進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證。 結(jié)果：在4096條基因中，難治性癲癇和正常對(duì)照組腦組織間存在明顯差異表達(dá)的基因451條，與突觸囊泡功能相關(guān)蛋白差異表達(dá)基因14條，上調(diào)的有l(wèi)O條，下調(diào)的有4條，其中與突觸囊泡循環(huán)再生相關(guān)的網(wǎng)格蛋白(clathrin)、突觸囊泡膜蛋白16(synaptotagmin16)等表達(dá)增強(qiáng)；運(yùn)用IT-PCR在mRNA水平進(jìn)一步證實(shí)網(wǎng)格蛋白、突觸囊泡膜蛋白16表達(dá)增強(qiáng)，運(yùn)用免疫組化對(duì)網(wǎng)格蛋白、

7、突觸囊泡膜蛋白I的蛋白產(chǎn)物驗(yàn)證顯示在難治性癲癇腦組織與突觸囊泡循環(huán)再生相關(guān)的網(wǎng)格蛋白、突觸囊泡膜蛋白I表達(dá)增強(qiáng)(P