下頜骨髁突軟骨與股骨頭軟骨體外培養(yǎng)下增殖分化的比較研究.pdf

1、髁突軟骨與股骨頭生長板軟骨是兩類不同的軟骨，生長發(fā)育期二者均通過軟骨內(nèi)成骨的方式參與骨的生長，其生長發(fā)育異常均可能引起下頜骨和長骨的生長發(fā)育障礙。髁突軟骨增殖層中含有未分化的間充質(zhì)細(xì)胞，在正常的生理環(huán)境下間充質(zhì)細(xì)胞可以分化為成骨細(xì)胞和成軟骨細(xì)胞。然而在一個(gè)非功能的環(huán)境下如體外培養(yǎng)、過度負(fù)載實(shí)驗(yàn)，髁突軟骨間充質(zhì)細(xì)胞的成軟骨分化會(huì)被成骨分化所替代。股骨頭生長板軟骨增殖層細(xì)胞通過增殖分化可形成前肥大層與肥大層軟骨細(xì)胞，并且可以誘導(dǎo)基質(zhì)鈣化發(fā)生

2、。透明質(zhì)酸具有修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨纖維層,維持未鈣化軟骨的厚度，保護(hù)受損害的軟骨的功能。 TGF-β具有促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖、調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)合成作用。
　　本課題擬在體外進(jìn)行髁突軟骨與股骨頭軟骨的組織培養(yǎng)，觀察其在體外增殖分化的特征，并加入透明質(zhì)酸、TGF-β1及其抑制劑探討其對于軟骨增殖分化的影響，為臨床上研究髁突軟骨的增殖分化與相關(guān)疾病的發(fā)生機(jī)制提供一定的理論支持。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　本實(shí)驗(yàn)采用新生2d的昆明小

3、鼠子鼠，在超凈工作臺(tái)內(nèi)，取其髁突軟骨與股骨頭軟骨放置于IMDM培養(yǎng)液內(nèi)進(jìn)行體外組織培養(yǎng)。采用大體觀察、軟骨面積測量、HE染色、茜素紅染色、堿性磷酸酶染色、Ⅹ型膠原及Ki67免疫組化的方法，研究其增殖分化的不同。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1、髁突軟骨在體外培養(yǎng)下增殖層、成熟層的軟骨細(xì)胞發(fā)生了肥大分化，并能自發(fā)基質(zhì)鈣化、軟骨內(nèi)成骨的過程。
　　髁突軟骨在體外培養(yǎng)4w后，髁突軟骨內(nèi)出現(xiàn)高密度光阻射區(qū)，隨著培養(yǎng)時(shí)間推進(jìn)，軟骨內(nèi)高密

4、度光阻射區(qū)沿著軟骨表層下方繼續(xù)向前緣發(fā)展。直至培養(yǎng)8w結(jié)束，肉眼可見髁突軟骨組織發(fā)生了成骨樣改變，并且占據(jù)了大部分髁突軟骨。軟骨面積測量顯示培養(yǎng)4w至8w結(jié)束，髁突軟骨面積測量無顯著變化（P>0.05）。HE染色顯示髁突軟骨增殖層與成熟層變薄，出現(xiàn)高密度光阻射區(qū)的軟骨細(xì)胞發(fā)生了肥大分化，茜素紅染色證實(shí)了基質(zhì)鈣化的發(fā)生，堿性磷酸酶與Ⅹ型膠原免疫組化研究進(jìn)一步說明軟骨細(xì)胞發(fā)生了肥大分化并且正在經(jīng)歷軟骨內(nèi)成骨的過程。Ki67免疫組化顯示培養(yǎng)8

5、w后軟骨細(xì)胞依然具有增殖活性，證實(shí)了體外培養(yǎng)方法的可行性。
　　2、股骨頭軟骨體外培養(yǎng)下軟骨面積顯著增大，但軟骨細(xì)胞尚未發(fā)生肥大分化。股骨頭軟骨在體外培養(yǎng)下自始至終軟骨內(nèi)未出現(xiàn)高密度光阻射區(qū)，然軟骨面積測量顯示培養(yǎng)初至培養(yǎng)8w結(jié)束，股骨頭軟骨面積顯著增大（P<0.05）。HE染色顯示股骨頭軟骨細(xì)胞體積明顯增大，軟骨層次清晰。茜素紅染色提示軟骨基質(zhì)未發(fā)生鈣化，且軟骨內(nèi)除肥大軟骨外其余軟骨層無堿性磷酸酶與Ⅹ型膠原表達(dá)，Ki67免疫組化

6、顯示培養(yǎng)8w后軟骨細(xì)胞依然具有增殖活性。
　　3、透明質(zhì)酸組中，髁突軟骨與股骨頭軟骨面積顯著增大，但髁突軟骨細(xì)胞的肥大分化受到了一定的抑制。
　　透明質(zhì)酸組髁突軟骨內(nèi)均未觀察到高密度光阻射區(qū)，與空白組相比，髁突軟骨培養(yǎng)2w、4w、6w、8w后，髁突軟骨面積測量均顯著增大（p<0.05）。HE染色顯示髁突軟骨纖維層與增殖層變薄，增殖層與成熟層軟骨細(xì)胞體積增大明顯，免疫組化提示培養(yǎng)8w后髁突軟骨未表達(dá)成熟肥大軟骨細(xì)胞的標(biāo)記物Ⅹ型

7、膠原與堿性磷酸酶活性。股骨頭軟骨內(nèi)均未出現(xiàn)高密度光阻射區(qū)，而股骨頭軟骨面積測量顯示：與空白組相比，HA組在不同的培養(yǎng)時(shí)間，股骨頭軟骨面積測量均顯著增大（p<0.05）。HE染色顯示培養(yǎng)8w后，透明質(zhì)酸組股骨頭各軟骨層細(xì)胞體積增大明顯，茜素紅染色、堿性磷酸酶、Ⅹ型膠原免疫組化顯示股骨頭軟骨細(xì)胞未發(fā)生肥大分化。
　　4、TGF-β1組中，股骨頭軟骨面積顯著增大，髁突軟骨細(xì)胞的肥大分化提前發(fā)生。
　　TGF-β1組中髁突軟骨培養(yǎng)2

8、w后，與空白組相比，髁突軟骨后緣與骨交界處提前出現(xiàn)高密度光阻射區(qū)。髁突面積測量顯示 TGF-β1對于髁突軟骨的增殖無顯著作用（p>0.05）。HE染色、茜素紅染色、堿性磷酸酶、Ⅹ型膠原免疫組化研究證實(shí)髁突軟骨發(fā)生了肥大分化，且正在經(jīng)歷基質(zhì)鈣化、軟骨內(nèi)成骨的過程。股骨頭軟骨內(nèi)未發(fā)現(xiàn)高密度光阻射區(qū)，股骨頭軟骨面積測量顯示：與空白組相比，TGF-β1組在不同的培養(yǎng)時(shí)間，股骨頭軟骨面積測量均顯著增大（p<0.05）。茜素紅染色、堿性磷酸酶、Ⅹ型

9、膠原免疫組化證實(shí)股骨頭軟骨細(xì)胞未發(fā)生肥大分化。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)論：
　　1、髁突軟骨與股骨頭軟骨在體外培養(yǎng)下具有不同的增殖分化特征：髁突軟骨經(jīng)歷了肥大分化、基質(zhì)鈣化以及軟骨內(nèi)成骨的過程，且基質(zhì)鈣化與增殖能力存在相關(guān)性；而股骨頭軟骨僅表現(xiàn)出較強(qiáng)的增殖能力。
　　2、髁突軟骨體外培養(yǎng)下增殖分化的特征很可能為臨床上研究與髁突發(fā)育相關(guān)疾病的發(fā)生機(jī)制提供了一個(gè)有用的工具。
　　3、在體外培養(yǎng)下，透明質(zhì)酸可以促進(jìn)髁突軟骨與股骨頭