粒細(xì)胞集落刺激因子在大鼠局灶性腦缺血中的療效與保護(hù)機(jī)制研究.pdf

1、一、研究背景： 缺血性腦卒中是最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)疾病，是目前致殘和致死的主要原因之一，給社會和家庭帶來沉重的負(fù)擔(dān)，其中最常見的是大腦中動脈供血區(qū)的腦梗死，約占腦梗死的75％左右。 在急性腦梗死的治療中，雖然超急性期組織纖溶酶原激活物和尿激酶的溶栓治療能取得明顯的療效，但溶栓治療時間窗小，并有其潛在的出血風(fēng)險，限制了它的廣泛應(yīng)用。以神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem

2、 cells，NSCs)和造血干細(xì)胞(haemopoietic stem cells，HSCs)為主的細(xì)胞替代治療近年來也取得較明顯的療效，但NSCs的不易獲得性和HSCs來源上的倫理問題，以及細(xì)胞移植存在的包括免疫排斥、感染及誘發(fā)惡性腫瘤風(fēng)險等一系列問題都限制了干細(xì)胞的發(fā)展與應(yīng)用，因此利用藥物刺激增強(qiáng)自體內(nèi)源性干細(xì)胞的修復(fù)功能成為新的研究靶向熱點(diǎn)。此時，粒細(xì)胞集落刺激因子(Granulocyte-colony stimulating

3、factor，G-CSF)做為內(nèi)源性HSCs的強(qiáng)力動員劑在CNS疾病的治療中引起了研究者極大的關(guān)注。 G-CSF在骨髓造血系統(tǒng)中能選擇性刺激粒細(xì)胞及其前體細(xì)胞的增殖、分化和成熟，已被廣泛用于干細(xì)胞的動員、骨髓重建以及血液系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤化療等引起的粒細(xì)胞減少癥的治療中。隨著G-CSF及其受體(G-CSFR)在非造血系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)，已有越來越多的研究證明，G-CSF在包括CNS在內(nèi)的非造血系統(tǒng)里尚有重要的功能，如在小鼠膿毒血癥中，G

4、-CSF具有抗炎作用，在多種自身免疫性疾病中具有免疫調(diào)節(jié)作用等。而且越來越多的研究證明，G-CSF在動物腦缺血模型中，能刺激內(nèi)源性神經(jīng)再生，動員骨髓HSCs入血并向腦組織缺血區(qū)靶向遷移“歸巢”，促進(jìn)新生血管的形成，G-CSF能與G-CSFR的結(jié)合還能導(dǎo)致直接抗凋亡作用，因而具有強(qiáng)大的神經(jīng)保護(hù)作用，G-CSF治療后動物腦水腫減輕、梗死體積減小、死亡率降低，神經(jīng)功能預(yù)后改善，但G-CSF是否能通過調(diào)節(jié)趨化因子的表達(dá)及T細(xì)胞的分泌功能來影響腦

5、梗死的炎癥病理過程尚未明確。 二、研究目的: 本課題通過建立大鼠永久性局灶性大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型來試圖闡明G-CSF是否能通過調(diào)節(jié)趨化因子的表達(dá)及T細(xì)胞的分泌功能來影響腦梗死的炎癥病理過程，同時進(jìn)一步驗(yàn)證G-CSF在腦梗死中的抗凋亡及促進(jìn)神經(jīng)、血管再生等保護(hù)機(jī)制，為G-CSF在腦梗死中的臨床應(yīng)用提供更進(jìn)一步的理論依據(jù)。 三、材料與方法:

6、 1.線栓法建立大鼠永久性MCAO模型； 2.動物分組與干預(yù)：A組：在MCAO術(shù)后2h開始給予單劑量G-CSF(50ug/kg)皮下注射治療一次，24h后取腦組織行RT-PCR、Western-blot及免疫組化檢測，同時設(shè)立相應(yīng)的假手術(shù)組(sham)與PBS對照組(control)(n=6)；B組：在MCAO術(shù)后2h開始給予G-CSF(50ug/kg)皮下注射連續(xù)治療3天，并在G-CSF治療前予BrdU 50mg/kg腹

7、腔注射，連續(xù)標(biāo)記3天，MCAO術(shù)后14d取腦，用于免疫熒光檢測，設(shè)立相應(yīng)PBS對照組(control)(n=8)； 3.TTC染色測定大鼠MCAO術(shù)后24h腦梗死體積； 4.對所有入組大鼠MCAO術(shù)后3d、7d、14d進(jìn)行平衡木試驗(yàn)與網(wǎng)屏試驗(yàn)評價大鼠運(yùn)動功能情況； 5.實(shí)時RT-PCR方法測定MCAO術(shù)后24h大鼠腦組織缺血區(qū)域TNF-α、TGF-β、IL-10等炎癥相關(guān)因子及趨化因子MCP-1 mRNA的表達(dá)水

8、平； 6.免疫組化方法檢測MCAO術(shù)后24h中性粒細(xì)胞表面標(biāo)記CD11b在大腦缺血區(qū)中的表達(dá)情況； 7.免疫組化與Western-blot方法測定MCAO術(shù)后24h腦組織缺血區(qū)抗凋亡蛋白Bcl-2與促凋亡蛋白Bax的表達(dá)； 8.免疫熒光雙標(biāo)法測定MCAO術(shù)后14d腦內(nèi)由標(biāo)志新生細(xì)胞的BrdU與神經(jīng)元(NeuN)、血管內(nèi)皮細(xì)胞(vWF)及星形膠質(zhì)細(xì)胞(GFAP)的共表達(dá)情況。 9.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：所有數(shù)據(jù)采用

9、-x±s表示，兩組間比較用t檢驗(yàn)，三組間比較用One-Way ANOVA方差分析，P＜0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 四、結(jié)果： 1.G-CSF治療組TTC染色所示梗死體積較PBS對照組明顯減小(P=0.001)： 2.G-CSF治療組大鼠7d、14d的運(yùn)動功能較PBS對照組改善； 3.在腦組織缺血區(qū)域，G-CSF治療組MCP-1mRNA水平較PBS對照組明顯減少(P=0.03)；IL-10、TGF-β m

10、RNA水平增高(P值分別為0.01、0.004)，但TNF-α mRNA水平在兩組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.88)； 4.MCAO術(shù)后24h CD11b在G-CSF治療組與PBS對照組中的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.61)； 5.在大鼠腦組織缺血區(qū)域，G-CSF治療組抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)較PBS對照組明顯增高(P=0.02)，促凋亡蛋白Bax水平較PBS對照組顯著降低(P=0.007)： 6.G-CSF治療

11、組BrdU陽性細(xì)胞數(shù)較PBS對照組明顯增)31(P＜0.001)，BrdU與NeuN、GFAP及vWF雙陽性細(xì)胞數(shù)增多。 五、結(jié)論： 1.在大鼠MCAO模型中，G-CSF治療能減少梗死體積，改善運(yùn)動功能的恢復(fù)； 2.在大鼠MCAO模型中，G-CSF治療能減少腦組織缺血區(qū)域趨化因子MCP-1 mRNA的表達(dá)；增加抗炎因子IL-10、TGF-β mRNA的表達(dá)，但對TNF-α mRNA水平無明顯影響；