重組人粒細(xì)胞集落刺激因子對腦缺血再灌注大鼠的神經(jīng)保護(hù)和自噬作用的研究.pdf

1、第一部分:重組人粒細(xì)胞集落刺激因子對腦缺血再灌注大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用
　　目的:利用局灶性腦缺血再灌注模型，觀察rhG-CSF對腦缺血后的神經(jīng)保護(hù)作用。
　　方法:健康雄性SD大鼠，質(zhì)量280～320g。隨機(jī)分為3組:假手術(shù)組(sham組)，生理鹽水對照組(Nacl組)，rhG-CSF治療組。每組又隨機(jī)分為缺血24h、7d和14d時間點(diǎn)組，每一時間點(diǎn)均為6只大鼠。線栓法制備大鼠大腦中動脈缺血(MCAO)模型:按Zea-Long

2、a5分制標(biāo)準(zhǔn)評分，其中0分和4分者被剔除。動物模型缺血90min時再灌注，于再灌注開始，治療組予rhG-CSF50μg/(kg·d)，腹部皮下注射，連續(xù)5天。生理鹽水對照組予等量生理鹽水。每只大鼠均于缺血再灌注24h、7d、14d時分別進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評分，評分標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用改良神經(jīng)功能缺損評分表。各組大鼠分別記錄死亡數(shù)。
　　結(jié)果:
　　1、死亡率統(tǒng)計:為保證Nacl組和rhG-CSF治療組每個時間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)成功動物數(shù)均為6只大鼠。

3、Nacl組共進(jìn)行39只大鼠的模型制作，總死亡率為53.85％(21/39)。給予50μg/(kg·d)的rhG-CSF治療組死亡動物較少，共進(jìn)行24只動物的模型制作，死亡率為25％(18/24)。兩者之間的差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2、神經(jīng)功能評分統(tǒng)計:缺血再灌注24h時，Nacl組和治療組較假手術(shù)組神經(jīng)功能評分上升，表明認(rèn)為神經(jīng)功能下降，差異有顯著性(P＜0.05)。但Nacl組和治療組神經(jīng)功能評分無明顯差異(P

4、=0.131)。缺血再灌注7d時，Nacl組和治療組較假手術(shù)組神經(jīng)功能評分差異有顯著性(P＜0.05)，治療組較Nacl組神經(jīng)功能評分差異有顯著性(P＜0.05)。即認(rèn)為治療組和Nacl組神經(jīng)功能均較假手術(shù)組差，但治療組神經(jīng)功能較Nacl組神經(jīng)功能恢復(fù)較好。缺血再灌注14d時，各組兩兩比較差異均有顯著性(P＜0.05)。即治療組神經(jīng)功能較Nacl組神經(jīng)功能恢復(fù)較好。
　　小結(jié):rhG-CSF能降低腦缺血大鼠死亡率;rhG-CSF能

5、改善腦缺血大鼠神經(jīng)功能，說明rhG-CSF具有神經(jīng)保護(hù)作用。
　　第二部分粒細(xì)胞集落刺激因子對腦缺血再灌注大鼠自噬作用的影響
　　目的:觀察rhG-CSF治療對腦缺血再灌注大鼠自噬的影響。
　　方法:健康雄性SD大鼠，質(zhì)量280～320g。隨機(jī)分為3組:假手術(shù)組(sham組)，生理鹽水對照(Nacl組)，rhG-CSF治療組。每組均為6只大鼠。線栓法制備大鼠大腦中動脈缺血(MCAO)模型:按Zea-Longa5分制標(biāo)準(zhǔn)

6、評分，其中0分和4分者被剔除。動物模型缺血90min時再灌注，于再灌注開始，治療組予rhG-CSF50μg/(kg·d)，腹部皮下注射，連續(xù)5天。生理鹽水對照組予等量生理鹽水。治療結(jié)束后取材。采用免疫組化法檢測LC3的表達(dá)，采用Westernblot檢測、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、LAMP-2a、HSC-70的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1、免疫組化結(jié)果:與假手術(shù)組相比，對照組及實(shí)驗(yàn)組大鼠的自噬蛋白LC3陽性表達(dá)高于假手術(shù)組，rhG-

7、CSF治療組的自噬蛋白LC3陽性表達(dá)要高于假手術(shù)組和生理鹽水對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義;
　　2、Westernblot結(jié)果:取腦缺血灶周邊區(qū)域腦組織;與假手術(shù)組相比，對照組及實(shí)驗(yàn)組大鼠LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、HSC-70及LAMP-2a表達(dá)明顯上調(diào)(P＜0.05);與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組大鼠LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、HSC-70及LAMP-2a表達(dá)明顯上調(diào)(P＜0.05)。
　　小結(jié):rhG-CSF可以在動物水平上調(diào)腦缺血灶周邊區(qū)域細(xì)胞

8、自噬的作用。
　　第三部分粒細(xì)胞集落刺激因子對腦缺血氧糖剝奪模型自噬的影響
　　目的:利用SH-SY5Y細(xì)胞制備氧糖剝奪模型，觀察rhG-CSF治療后自噬指標(biāo)的變化。
　　方法:取對數(shù)生長期SH-SY5Y細(xì)胞，隨機(jī)分為3組:對照組、低劑量rhG-CSF組、高劑量rhG-CSF組。用氧糖剝奪(OGD)法制作細(xì)胞缺氧模型，更換培養(yǎng)液為無血清，無糖人工腦脊液(nACSF)，培養(yǎng)30分鐘后移入至4000cm3恒溫(37℃)HE

9、RACELL150三氣培養(yǎng)箱，連續(xù)充以無氧氣體(90％N2，9％CO2和1％O2)，繼續(xù)培養(yǎng)4小時取出，更換原培養(yǎng)液，分別給予0μg/L，100μg/L和200μg/LrhG-CSF處理，繼續(xù)原環(huán)境培養(yǎng)完48h。
　　采用MTT比色法檢測細(xì)胞活性，以MDC熒光染色法檢測自噬空泡變化。Westernblot方法檢測LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、LAMP-2a、HSC-70的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1、細(xì)胞活性的變化:與0μg/Lr

10、hG-CSF對照組相比，100μg/L、200μg/LrhG-CSF對缺氧后SH-SY5Y細(xì)胞的增殖活性明顯增加(P＜0.05);與100μg/LrhG-CSF組相比，200μg/LrhG-CSF對缺氧后SH-SY5Y細(xì)胞的增殖活性明顯增加(P＜0.05)。顯示隨rhG-CSF藥物濃度的升高，細(xì)胞活力增加明顯。
　　2、自噬空泡數(shù)的變化:通過與對照組相比、rhG-CSF處理組的SH-SY5Y細(xì)胞進(jìn)行MDC染色，rhG-CSF處理組

11、細(xì)胞胞質(zhì)中出現(xiàn)大量的大小不一的點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)，隨著rhG-CSF濃度的增加，MDC染色陽性信號明顯增強(qiáng)，而未處理組的對照細(xì)胞胞質(zhì)中僅見零星的熒光陽性的小點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)，發(fā)光很弱，只可看見模糊細(xì)胞輪廓。統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示:與0μg/LrhG-CSF對照組相比，100μg/L、200μg/LrhG-CSF組自噬泡明顯增加(P＜0.05);與100μg/LrhG-CSF組相比，200g/LrhG-CSF自噬泡明顯增加(P＜0.05);顯示隨rhG-CSF藥物濃

12、度的升高，細(xì)胞自噬增加明顯。
　　3、Westernblot結(jié)果:rhG-CSF干預(yù)48小時后，100μg/L組的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、LAMP-2a及HSC-70水平要高于0μg/L組(P＜0.05);200μg/L組的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、LAMP-2a及HSC-70比值水平要高于100μg/L組(P＜0.05)。
　　小結(jié):1、rhG-CSF具有促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞增殖活力的作用;2、rhG-CSF可以在細(xì)胞水平上調(diào)缺血細(xì)胞自噬