重組人粒細胞集落刺激因子對糖尿病大鼠腦缺血后神經再生和神經細胞凋亡作用的研究.pdf

1、目的： 糖尿病合并腦梗死是引起人類死亡和殘疾的主要原因，目前尚缺少促進神經功能恢復的有效方法。干細胞療法是最有希望解決神經再生的方法。骨髓基質細胞移植治療腦缺血在動物實驗研究中已經取得了明顯的效果，但它仍然是一種復雜的操作，增加了感染的機會，并且有可能錯過治療的時間窗。重組人粒細胞集落刺激因子(rhG-CSF)是一種對調控骨髓干細胞增生、分化和存活有顯著作用的細胞因子，可動員造血干細胞和骨髓基質細胞進入血循環(huán)，在治療實驗性心肌缺

2、血和腦缺血方面效果顯著。本實驗試圖從rhG-CSF動員骨髓干細胞，激活腦內神經干細胞的角度探討rhG-CSF對糖尿病合并腦梗死的神經保護作用及其機制，觀察經過rhG-CSF干預之后，局灶性腦缺血糖尿病大鼠的神經功能和腦組織超微結構的變化，缺血周邊區(qū)G-CSFR、STAT3、pSTAT3、VEGF、IGF-1、BrdU表達的變化，TUNEL陽性的凋亡神經細胞及Bcl-2、VEGF的蛋白和基因變化，以及細胞共表達BrdU+NeuN+、Brd

3、U+GFAP+的情況，驗證rhG-CSF能否改善糖尿病大鼠合并腦梗死的神經功能，其作用是否通過增加VEGF、IGF-1的表達，拮抗神經細胞凋亡和促進神經再生而實現(xiàn)，以及其配體-受體的相互作用和信號轉導的可能途徑。 方法： 1、實驗動物模型制備及分組wister大鼠采用2次給藥法制備大鼠糖尿病模型，6周后采用線栓法制備大鼠大腦中動脈閉塞(MCAO)模型。隨機分成rhG-CSF干預組、對照組，每組又隨機分為缺血7d、14d和

4、21d時間點組，每一時間點均為12只大鼠。 2、rhG-CSF干預及BrdU標記rhG-CSF干預組大鼠術后每日皮下注射rhG-CSF50μg/kg，各時間點組按組分別注射7、14和21天。對照組注射等量的生理鹽水。各組均從術后第1天開始，腹腔注射BrdU10mg/kg.d，分別連續(xù)注射7、14和21天以標記處于分裂期的細胞。 3、神經功能評分每只動物均于術后第1天和處死前采用神經功能缺損評分標準(NSS)進行神經功能缺

5、損評分，觀察rhG-CSF對糖尿病腦缺血大鼠神經功能的影響。 4、透射電鏡觀察rhG-CSF對腦組織超微結構的改變。 5、Tunel染色方法檢測rhG-CSF對腦組織中神經細胞凋亡的影響。 6、免疫組化方法檢測rhG-CSF對腦組織中BrdU、G-CSFR、VEGF、IGF-1的表達的影響。 7、免疫熒光檢測rhG-CSF對腦組織中細胞共表達BrdU+NeuN+、BrdU+GFAP+情況的影響。

6、8、WesternBlot方法檢測rhG-CSF對腦組織中STAT3、pSTAT3、VEGF、BCL-2蛋白表達的影響。 9、RT-PCR方法檢測rhG-CSF對腦組織中神經細胞VEGF、BCL-2基因的mRNA表達的影響。 結果： 1、rhG-CSF干預組和對照組術后第1天的神經功能缺損評分無明顯差異；rhG-CSF干預組第7、14、21天的神經功能缺損評分明顯低于對照組(P＜0.01)。 2、透射電子

7、顯微鏡下觀察到對照組腦組織缺血后細胞核膜破裂，染色質邊聚，細胞膜破裂，各種細胞器破壞。rhG-CSF組也可觀察到上述破壞的神經元，但超微結構的損傷明顯減輕。 3、TUNEL染色結果顯示：rhG-CSF干預組第7、14、21天腦缺血周邊區(qū)TUNEL免疫陽性細胞數(shù)明顯少于對照組(P＜0.01)。 4、免疫組化染色結果顯示：rhG-CSF干預組第7、14、21天腦缺血周邊區(qū)VEGF免疫陽性細胞光密度值明顯多于對照組(P＜0.0

8、1)；rhG-CSF干預組第7、14、21天腦缺血周邊區(qū)IGF-1免疫陽性細胞光密度值明顯多于對照組(P＜0.01)；rhG-CSF干預組第7、14、21天腦缺血周邊區(qū)BrdU免疫陽性細胞數(shù)明顯多于對照組(P＜0.01)；rhG-CSF干預組第7、14、21天腦缺血周邊區(qū)G-CSFR免疫陽性細胞光密度值明顯多于對照組(P＜0.01)。 5、免疫熒光雙標染色結果顯示：rhG-CSF干預組腦缺血周邊區(qū)可觀察到共表達BrdU+NeuN

9、+細胞，對照組未觀察到共表達BrdU+NeuN+細胞；rhG-CSF干預組和對照組都未觀察到共表達BrdU+GFAP+細胞。 6、Westernblot結果顯示：rhG-CSF干預組第7、14、21天腦組織STAT3蛋白表達與對照組無顯著差異(P＞0.05)。rhG-CSF干預組第7、14、21天腦組織pSTAT3蛋白表達明顯高于對照組(P＜0.01)。rhG-CSF干預組第7、14、21天腦組織Bcl-2蛋白表達明顯高于對照組

10、(P＜0.01)。rhG-CSF干預組第7、14、21天腦組織VEGF蛋白表達明顯高于對照組(P＜0.01)。 7、RT-PCR結果顯示：rhG-CSF干預組第7、14、21天腦組織Bcl-2mRNA表達明顯高于對照組(P＜0.01)。rhG-CSF干預組第7、14、21天腦組織VEGFmRNA表達明顯高于對照組(P＜0.01)。 結論： 1、rhG-CSF能明顯改善糖尿病大鼠局灶性腦缺血后的神經功能。

11、2、rhG-CSF可以明顯減輕糖尿病大鼠局灶性腦缺血后的超微結構損害。 3、rhG-CSF可以明顯減少糖尿病大鼠局灶性腦缺血后的神經細胞凋亡；并能明顯增加抗凋亡因子Bcl-2的mRNA和蛋白的表達。 4、rhG-CSF可以增加腦缺血周邊區(qū)的VEGF、IGF-1、BrdU、G-CSFR蛋白的免疫組化表達。 5、rhG-CSF對STAT3蛋白的表達無明顯影響，能明顯增加pSTAT3蛋白的表達。 6、rhG-C