慢性粒細(xì)胞白血病急變細(xì)胞株多藥耐藥相關(guān)蛋白的蛋白質(zhì)組學(xué)分析及耐藥機(jī)制研究.pdf

1、腫瘤多藥耐藥是指腫瘤細(xì)胞對(duì)一種抗腫瘤藥物出現(xiàn)耐藥性的同時(shí)，對(duì)其他多種化學(xué)結(jié)構(gòu)不同、作用靶位不同的抗腫瘤藥物也產(chǎn)生耐藥。隨著腫瘤化療藥物的廣泛應(yīng)用，腫瘤的耐藥性問(wèn)題越來(lái)越突出，已成為腫瘤有效治療的主要障礙之一。目前醫(yī)學(xué)科學(xué)工作者研究腫瘤耐藥機(jī)制主要是從多藥耐藥基因表達(dá)的產(chǎn)物入手，探討此類產(chǎn)物引起的耐藥機(jī)制。主要包括P170糖蛋白、多藥耐藥相關(guān)蛋白、肺耐藥蛋白、乳腺癌耐藥相關(guān)蛋白、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ和谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶等多藥耐藥相關(guān)蛋白質(zhì)與腫

2、瘤多藥耐藥性相關(guān)。機(jī)制研究顯示，腫瘤細(xì)胞通過(guò)P170糖蛋白、多藥耐藥相關(guān)蛋白和乳腺癌耐藥相關(guān)蛋白的ATP泵功能使化療藥物攝取減少和外排增多，引起細(xì)胞內(nèi)化療藥物的絕對(duì)濃度降低；肺耐藥相關(guān)蛋白等可阻止以胞核為效應(yīng)點(diǎn)的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)到胞漿中，將進(jìn)入胞漿的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)到運(yùn)輸囊泡中，隔絕藥物作用，并以胞吐的方式排出體外；另外，藥物靶點(diǎn)在質(zhì)和量上的改變、腫瘤細(xì)胞解毒防御系統(tǒng)和DNA修復(fù)系統(tǒng)功能加強(qiáng)，以及細(xì)胞代謝的變化和腫瘤細(xì)胞抗凋亡能力增強(qiáng)均與腫瘤多藥耐藥有

3、關(guān)。雖然已有的研究揭示了一些腫瘤多藥耐藥機(jī)制，但目前仍然不能完全解釋腫瘤多藥耐藥現(xiàn)象并有效逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥。 慢性粒細(xì)胞白血病是常見(jiàn)的血液系統(tǒng)惡性腫瘤之一，占白血病的15-25％，各種年齡均可發(fā)病，以中年最多見(jiàn)。根據(jù)臨床進(jìn)展可分為三期：慢性期，加速期和急變期。急變期為慢粒白血病的終末期，臨床表現(xiàn)與急性白血病類似，可有髓外白血病的表現(xiàn)，預(yù)后極差，往往數(shù)月內(nèi)死亡，而主要原因?yàn)閷?duì)多種化療藥物不敏感及多藥耐藥。雖然慢粒多藥耐藥的發(fā)

4、生機(jī)制已經(jīng)被廣泛的研究，但耐藥機(jī)制仍不明了，與耐藥相關(guān)的蛋白質(zhì)譜仍未得以構(gòu)建。阿霉素耐藥細(xì)胞株K562/A02細(xì)胞株是用阿霉素逐步誘導(dǎo)慢粒急變細(xì)胞株--K562所建立的具有典型多藥耐藥特征的慢粒細(xì)胞株，K562/A02對(duì)阿霉素耐受同時(shí)也對(duì)長(zhǎng)春新堿、高三尖杉酯(HHT)等數(shù)種化療藥物產(chǎn)生抗藥性，但K562/A02的耐藥表型具體涉及到何組耐藥相關(guān)蛋白以及是否存在新的耐藥相關(guān)蛋白仍不清楚。本研究以慢粒耐藥細(xì)胞株K562/A02和其親本細(xì)胞株K

5、562為研究材料，采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)試圖篩選與白血病耐藥相關(guān)的蛋白質(zhì)簇，并尋找新的耐藥相關(guān)蛋白，為揭示白血病的耐藥機(jī)制、篩選新的針對(duì)耐藥蛋白的靶向藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究首先采用一步抽提法制備K562/A02和K562細(xì)胞株的總蛋白質(zhì)，應(yīng)用雙向凝膠電泳技術(shù)建立了重復(fù)性和分辨率均佳的K562/A02和K562細(xì)胞株總蛋白質(zhì)的雙向凝膠電泳圖譜；用PDQuest軟件對(duì)兩株細(xì)胞蛋白質(zhì)的雙向電泳圖譜進(jìn)行了比較，并采用MAILDI-TOF-MS對(duì)差

6、異表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行質(zhì)譜分析，獲取了MALDI-TOF-MS肽質(zhì)量指紋圖譜，數(shù)據(jù)庫(kù)搜索鑒定了全部17個(gè)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，其中谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)在K562/A02細(xì)胞株表達(dá)明顯上調(diào)，說(shuō)明K562/A02細(xì)胞的化療耐藥與其密切相關(guān)；此外，一種新的與耐藥相關(guān)的蛋白質(zhì)--線粒體ATP酶表達(dá)出現(xiàn)明顯的下調(diào)，對(duì)其與K562/A02耐藥是否相關(guān)及機(jī)制進(jìn)行了深入的追蹤研究。 為了證實(shí)比較蛋白質(zhì)組學(xué)的研究結(jié)果，采用Western印跡及Rea

7、l-time定量RT-PCR技術(shù)對(duì)部分差異表達(dá)蛋白質(zhì)在K562/A02和K562細(xì)胞株中的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)，Western印跡結(jié)果顯示，在K562/A02細(xì)胞株，GST蛋白表達(dá)較其親本細(xì)胞明顯增加；而線粒體ATP酶蛋白表達(dá)在K562/A02細(xì)胞呈顯著降低；Real-time PCR結(jié)果顯示K562/A02細(xì)胞GST mRNA表達(dá)較親本細(xì)胞增加了3.72倍，而線粒體ATP酶mRNA較親本細(xì)胞降低了7.07倍。上述觀察既從蛋白水平也從mR

8、NA水平驗(yàn)證了蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)現(xiàn)。 為了進(jìn)一步考證線粒體ATP酶是否與K562/A02的阿霉素耐藥相關(guān)和揭示線粒體ATP酶表達(dá)下調(diào)的調(diào)控機(jī)制，本研究采用甲基化特異性PCR檢測(cè)了K562/A02和K562細(xì)胞株中線粒體ATP酶基因的甲基化水平，并用甲基化抑制劑5-氮雜胞苷抑制K562/A02細(xì)胞株中線粒體ATP酶的甲基化后檢測(cè)其對(duì)阿霉素的耐藥性，結(jié)果顯示，K562/A02和K562細(xì)胞株均存在線粒體ATP酶不同程度的甲基化，而耐藥株

9、的甲基化程度更高；用5-氮雜胞苷抑制線粒體ATP酶的甲基化可增強(qiáng)K562/A02對(duì)阿霉素的化療敏感性，部分逆轉(zhuǎn)了耐藥行為，從而證實(shí)線粒體ATP酶為K562/A02的耐藥相關(guān)蛋白。 本研究在建立K562/A02和。K562細(xì)胞蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜的基礎(chǔ)上，采用質(zhì)譜分析結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)搜索共鑒定出17個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)，其中一些蛋白質(zhì)是已知的耐藥相關(guān)蛋白質(zhì)，如GST，本研究發(fā)現(xiàn)線粒體ATP酶是慢粒耐藥相關(guān)蛋白質(zhì)，該蛋白在K562/A02的表達(dá)