高發(fā)區(qū)（大連）胃癌發(fā)病分子基礎(chǔ)的探討.pdf

1、目的： 胃癌是我國最常見的、同時也是世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率均較高的消化道惡性腫瘤之一。由于起病隱蔽，臨床病人多為晚期患者，死亡率高居全球惡性腫瘤死亡率的第二位。其發(fā)生具有多因素、多步驟、多基因和多途徑的特點。目前對胃癌缺乏準(zhǔn)確有效的早期診斷方法是造成胃癌高死亡率的主要原因。因此深入了解胃癌發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移機制，制訂預(yù)測、早期診斷和早期阻斷的有效措施尤為重要。 大連地區(qū)是胃癌高發(fā)區(qū)，具有比較特殊的地理地貌特點以及生態(tài)學(xué)環(huán)

2、境。本地居民也有獨特的生活飲食習(xí)慣和相對封閉的遺傳學(xué)背景。而這些環(huán)境因素和遺傳因素都在胃癌的發(fā)生過程中發(fā)揮作用，針對這些因素的流行病學(xué)調(diào)查將有助于我們進(jìn)一步加深對胃癌發(fā)生的分子生物學(xué)機制的理解。研究大連地區(qū)胃癌發(fā)生發(fā)展過程中的分子改變及周圍環(huán)境的影響有助于人們深入認(rèn)識胃癌在該地區(qū)的發(fā)生機制，對于制定胃癌的預(yù)防，早期診斷和治療策略具有重要的意義。 環(huán)境中的化學(xué)致癌物多為間接致癌物，即致癌物前體。它們在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)過代謝活化后才具有致癌

3、活性。細(xì)胞色素P450就是催化此類代謝活化反應(yīng)的一組氧化酶。它們分布于多種臟器主質(zhì)細(xì)胞的滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，主要負(fù)責(zé)包括環(huán)境致癌物在內(nèi)的外源性化合物的代謝解毒與活化。某些活化產(chǎn)物能夠損傷生物大分子或形成DNA加合物進(jìn)而激活原癌基因?qū)е掳┌Y發(fā)生。研究表明，大多數(shù)已知的環(huán)境化學(xué)致癌物都是CYP450的作用底物。 CYP1A1基因是P450超基因家族中的一個重要成員。它可以被多種內(nèi)、外源性多環(huán)芳烴類化合物如苯并芘誘導(dǎo)表達(dá)。其基因產(chǎn)物為芳烴羥

4、化酶，可將多環(huán)芳烴類化合物代謝活化為環(huán)氟類化合物而進(jìn)一步發(fā)揮致癌、致突變作用。有關(guān)CYP1A1表達(dá)在多階段胃癌發(fā)生中的作用少見報道。鑒于大連地區(qū)人群有進(jìn)食含有過量致癌物前體食品的習(xí)慣，我們對本地區(qū)胃癌組織中CYP1Al的表達(dá)特點及其與多階段胃癌發(fā)生的關(guān)系加以分析：同時對CYP1Al基因表達(dá)調(diào)控機制以及大連地區(qū)人群CYP1Al基因多態(tài)性分布進(jìn)行了研究。 我們在前期工作中發(fā)現(xiàn)了大連地區(qū)胃癌COX-2基因啟動子區(qū)域異常甲基化導(dǎo)致的CO

5、X-2基因的表達(dá)缺失。這一現(xiàn)象雖然和以往的許多研究結(jié)果有所不同，但是我們認(rèn)為其含義深遠(yuǎn)，即它強烈地提示我們大連地區(qū)胃癌的高發(fā)機制可能與其他地區(qū)胃癌的發(fā)生機制不同——主要依賴于一種異常甲基化的表觀遺傳學(xué)改變途徑，這可能是大連地區(qū)胃癌發(fā)病率高的始因。而這種表觀遺傳學(xué)改變與大連地區(qū)特殊的環(huán)境因素及本地區(qū)人群遺傳背景有關(guān)。 表觀遺傳學(xué)改變是一種未涉及DNA序列變化的基因外調(diào)控機制，主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾等。其中DNA甲基化是目

6、前人們研究最為深入的一種表觀遺傳學(xué)修飾方式，主要發(fā)生在CpG二核苷酸序列的胞嘧啶上，并證實與多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。DNA甲基化的可誘導(dǎo)性和可逆性特點也為腫瘤發(fā)生機制探討和腫瘤治療提供了新的思路。結(jié)合大連地區(qū)地理流行病學(xué)特點以及生活飲食習(xí)慣，飲食中的許多成分都被證實是促甲基化劑。因此對本地區(qū)胃癌患者以及正常對照人群多基因多位點的DNA甲基化特點(也稱CpG島甲基化表型，CpG Island　Methylator Phenotype，CI

7、MP)比較分析就顯得尤為有意義。不僅可以發(fā)現(xiàn)胃癌患者的CIMP型特征，而且可以判斷未患個體的甲基化易感性，進(jìn)而預(yù)測個體發(fā)病風(fēng)險。為本地區(qū)胃癌的預(yù)防、預(yù)測和早期診斷提供理論指導(dǎo)。 我們的研究目的在于通過檢測特定區(qū)域腫瘤、癌前病變、癌旁相對正常以及、非癌正常對照胃粘膜組織的遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)改變，判斷遺傳因素和環(huán)境因素在腫瘤發(fā)生過程中的作用及相互聯(lián)系。探討大連胃癌高發(fā)區(qū)胃癌發(fā)病機制，為胃癌臨床早期診斷、預(yù)防乃至治療方法的選擇提供新的

8、依據(jù)和思路。 方法： 全部標(biāo)本來自大連醫(yī)科大學(xué)遼寧省(高校)癌癥基因組重點實驗室建立的人胃癌組織庫。在冰凍組織微陣列技術(shù)和定點捕獲技術(shù)基礎(chǔ)上，應(yīng)用免疫組化、RT-PCR、酶活性分析、Western蛋白印跡分析、PCR-SSCP、RFLP-PCR以及MS-PCR等方法，分別對不同病變胃粘膜組織和癌旁相對正常組織中CYP1Al基因表達(dá)特點進(jìn)行分析，并對其基因表達(dá)調(diào)控機制如AhR基因共表達(dá)及核易位以及該基因Msp I和Exon

9、7多態(tài)性與腫瘤易感性的關(guān)系進(jìn)行探索；同時應(yīng)用甲基化特異性PCR檢測了5個常用CIMP鑒定位點以及與胃癌的惡性表型密切相關(guān)的CDH1基因5’啟動子區(qū)的甲基化狀態(tài)。實驗數(shù)據(jù)采用SPSS12.0軟件包應(yīng)用Kruskal-Wallis和Mamm Whitney檢驗方法進(jìn)行統(tǒng)計分析。 結(jié)果： 一.CYP1A1基因在不同病變胃粘膜組織中的表達(dá)情況免疫組化結(jié)果顯示：在癌旁相對正常、癌前病變以及胃癌組中，CYP1A1基因表達(dá)率分別為11

10、.1％(1/9)，60％(12/20)和86.0％(37/43)，組間差別顯著，具有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.005)。RT-PCR.和Western印跡雜交結(jié)果基本與之符合。 二. AhR基因在不同病變胃組織中的表達(dá)與核易位特點在39例胃癌樣本中，有37例AhR基因表達(dá)，同時這37例樣本都發(fā)生了AhR蛋白的核內(nèi)表達(dá)(核易位)，總陽性率和核易位率均為94.9％(37/39)；在6例癌旁相對正常胃粘膜組織標(biāo)本中，有3例表現(xiàn)為弱陽性(+)

11、，陽性率為50％，其中只有l(wèi)例發(fā)生核易位，核易位率僅為16.7％(1/6)。計數(shù)資料統(tǒng)計學(xué)檢驗結(jié)果顯示：不同病變胃粘膜組織(胃癌和癌前病變)中的AhR基因表達(dá)水平要明顯高于癌旁相對正常組織(p<0.05)；AhR蛋白的核內(nèi)表達(dá)(核易位)在與CYP1A1基因的高表達(dá)存在正相關(guān)(rs=0.437，p<0.01)。 三.CYP1A1基因多態(tài)性分析1、MspI多態(tài)性分析在胃癌組中，m1m1、m1m2和m2m2基因型頻率分別為43.3％、

12、45％和11.7％；在正常對照組為45.6％、49.1％和5.3％。兩組間基因頻率差別無統(tǒng)計學(xué)意義，從而證明CYP1A1基因的MspI多態(tài)性與胃癌易感性無顯著相關(guān)性。 2、Exon 7多態(tài)性分析胃癌組Ile/Ile、Ile/Val Val/Val基因型頻率分別為Ile/Ile型26.7％、50％和23.3％；正常對照組為52.6％、28.1％和19.3％。同樣，組間基因頻率差別無統(tǒng)計學(xué)意義。 3、CYP1A1基因多態(tài)性與

13、表達(dá)的關(guān)系RT-PCR和免疫組化結(jié)果基本一致：易感基因型m2m2和Val/Val個體CYP1A1表達(dá)率均為100％。而非易感基因型個體CYP1A1表達(dá)率為54-72％。組間統(tǒng)計學(xué)有顯著差異(p<0.05)，說明CYP1A1基因多態(tài)性可以明顯地影響酶的表達(dá)量及活性。 四.大連地區(qū)進(jìn)展期胃癌的CIMP分布特征CIMP-H在胃癌、癌前以及癌旁相對正常組織中的發(fā)生率分別為51.1％(24/47)、23.8％(5/21)和0％(0/16)

14、；CIMP-L，分別為38.3％(18/47)、71.4％(15/21)和75％(12/16)；而CIMP-N則分別為10.6％(5/47)、4.8％(1/21)和25％(4/16)，在不同進(jìn)展期胃癌組間差異顯著(p=0.001)。結(jié)果說明多位點甲基化與胃癌進(jìn)展有關(guān)。隨著胃癌的演進(jìn)，甲基化基因種類明顯增多，甲基化程度增強。非癌患者檢測結(jié)果全部31例正常對照中無CIMP-H型個體，但出現(xiàn)38.7％(12／31)的CIMP-L個體。除p16

15、外的其他4個位點的甲基化情況與胃癌組相比存在較大差異，具有統(tǒng)計學(xué)意義(19=0-0．008)。 五．CDH1啟動子甲基化檢測胃癌粘膜組織中CDH1基因啟動子甲基化率為48．9％(23／47)，與胃癌CIMP型、進(jìn)展、年齡因素及腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。 六．大連地區(qū)胃癌CIMP分布與CYP1A1基因表達(dá)的相關(guān)性分析CYPA1在CIMP-H組中的檢測陽性率為100％(20／20)，在CIMP-L／N組中的檢測陽性率為62．5

16、％(10／16)，組間差異顯著(p<0．01)。 結(jié)論： 一．CYP1A1基因表達(dá)是大連地區(qū)胃癌發(fā)病過程中的一個重要分子事件，出現(xiàn)于胃癌發(fā)生早期并貫穿始終，在不同進(jìn)展期胃癌組織中CYP1A1表達(dá)水平不同?？梢园阉鳛楹饬凯h(huán)境化學(xué)致癌因子影響和判斷大連高發(fā)區(qū)胃癌病變程度的潛在分子標(biāo)記物； 二．大連地區(qū)胃癌中CYP1A1基因的高表達(dá)是由外源環(huán)境化學(xué)因素誘導(dǎo)并由AhR介導(dǎo)途徑實現(xiàn)； 三．CYP1A1基因多態(tài)性與

17、大連地區(qū)胃癌易患性未見明顯相關(guān)性。但不同基因型個體CYP1A1表達(dá)及酶活性存在顯著差異。這說明，易感基因型個體易被誘導(dǎo)表達(dá)且酶活性增高，但由于本地區(qū)可能存在較強有力的環(huán)境暴露因子，因而導(dǎo)致易感基因型及非易感基因型個體的易患性高度都可超過閾值而發(fā)??； 四．胃癌不同病變組與正常對照組中CIMP型分布有顯著差異，說明大連高發(fā)區(qū)胃癌的發(fā)生可能依賴于一種異常甲基化途徑；異常甲基化在本地區(qū)胃癌發(fā)生過程中屬早期事件，并隨疾病的演進(jìn)而增強;