端粒長度及其相關(guān)遺傳變異與胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的分子流行病學(xué)研究.pdf

1、胃癌是全世界最常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著人類健康。我國是全球胃癌疾病負(fù)擔(dān)最重的國家之一，闡明胃癌發(fā)生相關(guān)影響因素，提高胃癌的防治水平具有重要的公共衛(wèi)生意義。胃癌的發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的多階段癌變過程，受到環(huán)境因素和遺傳因素的共同作用。幽門螺旋桿菌(Helicobacter Pylori，HP)感染、N-亞硝基化合物、多環(huán)芳烴化合物、鹽腌食品、煙草和酒精暴露等因素已被證明是影響胃癌發(fā)病的主要環(huán)境因素，而擁有不同遺傳背景的個(gè)體之間被證明存在胃

2、癌的易感性差異。由于腫瘤發(fā)生機(jī)制的高度復(fù)雜性和廣泛異質(zhì)性，胃癌的病因及其相關(guān)機(jī)制尚未完全闡明，仍需開展深入的研究和探索。端粒(Telomere)是線性染色體末端由TTAGGG六個(gè)堿基串聯(lián)重復(fù)序列構(gòu)成的一種特殊保護(hù)性結(jié)構(gòu)，在維持染色體的完整性和基因組穩(wěn)定性方面具有極其重要的作用。在正常體細(xì)胞復(fù)制的過程中，端粒隨著每一次復(fù)制而進(jìn)行性縮短。因此，端粒長度可以在一定程度上反映機(jī)體在細(xì)胞水平的衰老程度，也具有成為能反映腫瘤等衰老相關(guān)疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)標(biāo)

3、志的巨大潛力。目前很多研究對(duì)端粒長度進(jìn)行檢測以研究其與疾病的關(guān)系。盡管組織來源的細(xì)胞相比于外周血白細(xì)胞可以為研究端粒長度與特定疾病關(guān)系提供更直接的證據(jù)，但由于外周血樣本更加容易獲取且對(duì)于被研究者的創(chuàng)傷小，且不同組織間端粒長度存在高度的相關(guān)性，使得外周血成為研究端粒長度最主要的替代組織。本研究分為兩個(gè)部分：
　　第一部分：端粒長度與胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的病例-對(duì)照研究。端粒異常導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定是腫瘤發(fā)生重要的標(biāo)志性分子事件。流行病學(xué)研究已經(jīng)

4、對(duì)端粒長度與一些常見腫瘤發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系進(jìn)行了深入探討。對(duì)于胃癌也有少量研究涉及，但這些研究不僅樣本量較小而且結(jié)論也不一致。例如，Liu等研究者對(duì)來自中國人群的396例胃癌病例和378例健康對(duì)照的端粒長度進(jìn)行檢測和分析后發(fā)現(xiàn)，較短的端粒長度可顯著增加胃癌的風(fēng)險(xiǎn)(OR=2.14，95％CI:1.52-2.93)，而在一項(xiàng)來自歐洲人群的前瞻性研究卻沒有發(fā)現(xiàn)端粒長度與胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性風(fēng)險(xiǎn)比為1.04(95％CI:0.77-1.39)。因此，

5、鑒于已有胃癌相關(guān)研究的不一致結(jié)論，本研究采用大樣本病例對(duì)照設(shè)計(jì)研究外周血相對(duì)端粒長度與胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系。病例為江蘇地區(qū)醫(yī)院來源的1，136例新發(fā)胃癌病例，對(duì)照樣本為來源于江蘇地區(qū)社區(qū)慢病篩查人群的1，012例健康個(gè)體。采用定量PCR方法檢測端粒長度，利用特異性引物分別擴(kuò)增同一個(gè)體外周血基因組DNA中端粒序列的拷貝數(shù)(Telomere，T)和單拷貝基因序列拷貝數(shù)(Single copy gene，S)，通過端粒序列和單拷貝基因序列拷貝數(shù)

6、的比值(T/S)來定量相對(duì)端粒長度(Relative telomere length，RTL)。采用盲法、復(fù)孔平行設(shè)置和重復(fù)檢測等質(zhì)量控制措施以保證端粒長度檢測的準(zhǔn)確性。采用Logistic回歸模型分析不同端粒長度等級(jí)（按照對(duì)照樣本端粒長度的三分位數(shù)、四分位數(shù)和五分位數(shù)將病例對(duì)照全部樣本端粒長度進(jìn)行分組）個(gè)體的胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，計(jì)算OR值和95％可信區(qū)間。用限制性立方樣條函數(shù)Logistic回歸模型分析端粒長度與胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)之間的劑量反應(yīng)關(guān)

7、系。研究結(jié)果顯示，端粒長度與年齡和性別顯著相關(guān)，高齡組（中位數(shù):1.39，四分位數(shù)間距:1.08-1.68）低于低齡組(1.58，1.32-1.93，P＜0.001)，男性(1.46，1.17-1.75)低于女性（1.58，1.24-1.94，P＜0.001）。胃癌組的平均端粒長度(1.28，0.94-1.69)顯著低于對(duì)照組(1.49，1.20-1.80，P＜0.001)。限制性立方樣條函數(shù)分析顯示，端粒長度與胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)呈顯著“U”

8、型關(guān)系(P＜0.001)。將研究對(duì)象以對(duì)照組端粒長度的五分位數(shù)進(jìn)行分組，與第四分位數(shù)組相比，第五（端粒最長）、第三、第二和第一分位數(shù)組（端粒最短）胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)均增加，OR值(95％CI)依次為1.78(1.30-2.44)、1.28（0.93-1.77）、1.65（1.21-2.26）和3.81(2.82-5.13)。研究表明，端粒長度與胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)呈現(xiàn)非線性的“U”型關(guān)系，端粒過長或過短均增加胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。本研究首次發(fā)現(xiàn)了端粒長度與

9、胃癌風(fēng)險(xiǎn)這一復(fù)雜關(guān)系，研究結(jié)果將為揭示端粒在胃癌發(fā)生中的作用以及深入闡明胃癌的病因提供了重要線索。
　　第二部分：端粒長度全基因組關(guān)聯(lián)研究：近年來，應(yīng)用全基因組關(guān)聯(lián)研究(Genome-wide association study，GWAS)方法研究表型相關(guān)的遺傳位點(diǎn)已成為國際研究熱點(diǎn)。多篇?dú)W洲人群GWAS報(bào)道了端粒長度與基因組遺傳變異的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)了多個(gè)端粒長度相關(guān)的染色體區(qū)域和基因（3q26,TERC;4q32.2,NAF1;5p

10、15.33,TERT10q24.33,OBFC1;20q13.3,RTEL1;2p16.2，ACYP2;19p12，ZNF208）。這些研究所取得的重要發(fā)現(xiàn)將為闡明影響歐洲人群端粒長度的遺傳機(jī)制提供重要線索。但是，目前中國人群中端粒長度相關(guān)遺傳變異的研究較少。Liu等研究者在中國人群中開展的一項(xiàng)GWAS研究報(bào)道了5p13.33（rs2736100，P=1.93×10-5）和12q13.13(rs17653722，P=6.96×10-6)

11、區(qū)域的兩個(gè)位點(diǎn)與端粒長度顯著相關(guān)，并且其中rs2736100與歐洲人群研究報(bào)道的一致，但是這兩個(gè)位點(diǎn)顯著性水平均沒有達(dá)到GWAS標(biāo)準(zhǔn)(P＜5×10-8)。鑒于目前影響中國人群端粒長度的遺傳變異尚不明確，本研究開展了端粒長度GWAS，利用Affymetrix GeneChip Human Mapping6.0芯片和Illumina Omni中華芯片分別對(duì)來自常州社區(qū)慢病篩查隊(duì)列的1，012例(GWASⅠ)和張家港社區(qū)健康體檢人群的948例

12、(GWASⅡ)研究對(duì)象外周血DNA樣本進(jìn)行全基因組基因分型，同時(shí)應(yīng)用定量PCR方法檢測所有樣本的相對(duì)端粒長度，開展這兩個(gè)人群的端粒長度GWAS研究，通過逆方差加權(quán)Meta對(duì)兩個(gè)人群GWAS結(jié)果進(jìn)行合并分析。并進(jìn)一步利用Sequenom MassARRA平臺(tái)在867例山東來源樣本中驗(yàn)證初篩發(fā)現(xiàn)的潛在陽性端粒長度相關(guān)遺傳變異。利用TaqMan7900基因分型平臺(tái)在病例對(duì)照樣本（1，136例病例和1，012例對(duì)照:同第一部分研究病例）中對(duì)我們

13、GWAS發(fā)現(xiàn)的位點(diǎn)以及歐洲人群GWAS已報(bào)道端粒長度相關(guān)位點(diǎn)與胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系進(jìn)行研究。遺傳變異與端粒長度的相關(guān)性采用一般線性模型分析，遺傳變異、端粒長度和遺傳評(píng)分與胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系采用Logistic回歸模型分析。研究結(jié)果顯示，位于染色體9p24.1區(qū)域的遺傳變異rs78744096在三個(gè)人群均與端粒長度相關(guān)(GWASⅠ:β=0.470，P=1.79×10-3; GWASⅡ:β=0.509，P=8.04×10-4;驗(yàn)證人群:β=0