Ad-PTEN聯(lián)合PI3K抑制劑LY294002抑制人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系LN229增殖和侵襲的研究.pdf

1、膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見(jiàn)的原發(fā)腫瘤,術(shù)后復(fù)發(fā)率高,血腦屏障的存在使常規(guī)化療藥物難以發(fā)揮作用,即使采取包括手術(shù)、放化療、免疫治療在內(nèi)的綜合治療,預(yù)后仍然不佳。膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展是多因素作用的結(jié)果,與癌基因的激活和抑癌基因的失活密切相關(guān)。P13K/AKT(磷酸肌醇3-激酶/絲-蘇氨酸激酶)信號(hào)通路與膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。PTEN(第10號(hào)染色體缺失性磷酸酶和張力蛋白同源物基因)是具有磷酸酯酶活性的抑癌基因,能夠拮抗P13K/AKT通路表達(dá)。

2、PTEN還通過(guò)絲裂原活化蛋白激酶(MPKA)、粘著斑激酶(FAK)等通路參與細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、遷移、分化等過(guò)程。它們都是膠質(zhì)瘤基因治療的理想靶點(diǎn)。
　　 本課題重點(diǎn)研究了攜帶野生型PTEN基因的重組腺病毒(Ad-PTEN)和P13K的小分子抑制劑(SMIs)LY294002對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用,及兩者之間的協(xié)同作用,并探討了P13K/AKT通路在人腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的作用和機(jī)制,嘗試了多靶點(diǎn)聯(lián)合基因治療在膠質(zhì)瘤中的作用。

3、
　　 本課題研究分為以下三個(gè)部分。
　　 第一部分:攜帶野生型PTEN基因的重組腺病毒(Ad-PTEN)在人胚胎腎上皮細(xì)胞HEK293中進(jìn)行擴(kuò)增,并用噬菌斑法測(cè)定其滴度為8×109。利用腺病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)和Western-Blot法確定攜帶野生型PTEN基因的重組腺病毒(Ad-PTEN)轉(zhuǎn)染LN229細(xì)胞的最佳感染復(fù)數(shù)值(MOI值)為100。用四唑鹽(MTT)比色法測(cè)出LY294002在LN229中的半數(shù)抑制率(IC50)

4、為16.33μmol/L,聯(lián)合轉(zhuǎn)染Ad-PTEN后的藥物半抑制率(IC50)為8.32μmol/L,提示Ad-PTEN對(duì)LY294002有增敏效果,兩者均在臨床用藥安全范圍之內(nèi)。
　　 第二部分:側(cè)重在體外部分對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系LN229進(jìn)行研究,將LN229細(xì)胞分成6組:①空白對(duì)照組、②DMSO組、③空載病毒組、④Ad-PTEN組、⑤LY294002組、⑥Ad-PTEN+LY294002聯(lián)合治療組。分別用MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率

5、、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期、AnnexinV-FITC法檢測(cè)細(xì)胞凋亡、Transwell法和劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲和遷移能力,Westernblot檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明:MTT顯示,與LN229對(duì)照組、DMSO組和空載病毒組比較,Ad-PTEN組、LY294002組和Ad-PTEN+LY294002聯(lián)合治療組細(xì)胞的生長(zhǎng)在治療48h后出現(xiàn)明顯抑制,以Ad-PTEN+LY294002聯(lián)合治療組對(duì)LN229細(xì)胞增殖的抑制作用最為明顯。流式

6、細(xì)胞周期分析顯示:Ad-PTEN組、LY294002組和聯(lián)合治療組的細(xì)胞與其他三組LN229細(xì)胞相比,S期比例依次降低,細(xì)胞阻滯于G0/G1期,聯(lián)合治療組的G0/G1阻滯明顯高于其他各組。細(xì)胞凋亡檢測(cè):Ad-PTEN組、LY294002組和聯(lián)合治療組的凋亡率較之其他三組凋亡率出現(xiàn)下降,以后者的凋亡率下降最為顯著。Transwell實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明:Ad-PTEN組、LY294002組和聯(lián)合組治療后,LN229細(xì)胞系的侵襲和遷移細(xì)

7、胞絕對(duì)數(shù)減少,以聯(lián)合治療組下降幅度最大。Westernblot檢測(cè)發(fā)現(xiàn):Ad-PTEN組、LY294002組和聯(lián)合組分別治療LN229細(xì)胞后,P13K/AKT通路下游蛋白P13K、p-AKT、PCNA、Bcl-2、MMP-2、MMP-9及CyclinD1表達(dá)水平均有明顯的下調(diào),其中聯(lián)合治療組中下調(diào)程度較單獨(dú)用藥顯著；而抑癌蛋白Caspase-3的表達(dá)則明顯上調(diào),Ad-PTEN組和聯(lián)合治療組的出現(xiàn)PTEN蛋白上調(diào),FAK蛋白下調(diào)。

8、　　 第三部分為體內(nèi)實(shí)驗(yàn),利用LN229裸鼠移植瘤皮下模型進(jìn)行研究。將裸鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、DMSO組、空載病毒組、轉(zhuǎn)染Ad-PTEN組、LY294002組、聯(lián)合治療組。瘤內(nèi)多點(diǎn)注射給藥,并繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。動(dòng)物處死后取出腫瘤組織,免疫組化染色。結(jié)果顯示:Ad-PTEN組、LY294002組和聯(lián)合治療組中P13K、p-AKT、MMP2、MMP9、PCNA、Bcl-2及cyclinD1蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào),而抑癌蛋白Caspase-3

9、的表達(dá)則明顯升高,并以聯(lián)合治療組對(duì)蛋白的影響最為顯著。Ad-PTEN組和聯(lián)合治療組的PTEN蛋白上調(diào),FAK蛋白下調(diào)。
　　 結(jié)論：
　　 1.LY294002單獨(dú)作用于人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系LN229的IC50值為16.33μmol/l,聯(lián)合Ad-PTEN后的IC50值為8.32μmol/l,均在臨床應(yīng)用的安全范圍之內(nèi),可以作為治療LN229細(xì)胞系的給藥濃度。
　　 2.在體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)中LY294002和.Ad-PTE

10、N可以引起人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系LN229周期阻滯在G0/G1期、凋亡增加、存活率下降,侵襲和遷移的細(xì)胞數(shù)目減少。但以?xún)烧呗?lián)合應(yīng)用效果最佳,體現(xiàn)兩者具有正向協(xié)同作用。
　　 3.LY294002與Ad-PTEN兩者聯(lián)合應(yīng)用所起正向協(xié)同作用與P13K/AKT下游的PCNA、CyclinD1、Bcl-2、MMP2、MMP9蛋白水平下降和caspase-3蛋白水平上升有關(guān)。并且,PTEN可以通過(guò)抑制FAK表達(dá)改變?nèi)四z質(zhì)瘤細(xì)胞系LN229的生物