PI3K和MAPK抑制劑對FOXO1的活性調(diào)節(jié)及其對胃間質(zhì)瘤細(xì)胞系GIST-T1細(xì)胞生物學(xué)行為的影響.pdf

1、胃腸道間質(zhì)瘤（gastrointestinal stromal tumors，GISTs）是消化道最常見的間葉組織腫瘤。目前普遍認(rèn)為GISTs起源于向cajal細(xì)胞分化的原始間葉細(xì)胞或幼稚干細(xì)胞，具有多向分化特征，可以向平滑肌、神經(jīng)分化或不定向分化，是一種具有惡性潛能的胃腸道腫瘤，但其確切起源尚不明確。其發(fā)病率為1～2/10萬人口，似乎正逐漸增加。近年來有研究表明，PI3K（磷脂酰肌醇-3-激酶）和MAPK（絲裂原活化蛋白激酶）信號通路

2、活性在胃腸道間質(zhì)瘤顯著增高。MAPK通路和PI3K通路是傳遞細(xì)胞增殖信號的兩個重要通路，二者之間存在一定程度的相互作用，而FOXO1蛋白正處于這兩種信號途徑的共同交匯點，參與細(xì)胞增殖與凋亡調(diào)節(jié)。FOXO是Forkhead蛋白家族的一個亞群，其中FOXO1是FOXO家族中發(fā)現(xiàn)最早的成員之一。有研究證實FOXO1是抑癌基因，能夠影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。PI3K/Akt（磷脂酰肌醇-3-激酶）和MAPK/ERK MAPK（絲裂原活化蛋白激酶）信

3、號傳導(dǎo)通路均可調(diào)節(jié)FOXO1轉(zhuǎn)錄因子的活性，在這兩條信號通路異常激活的作用下，F(xiàn)OXO1蛋白分子中的保守性位點發(fā)生磷酸化并從胞核輸出，與14-3-3蛋白在胞質(zhì)內(nèi)結(jié)合，從而封閉了自身的核定位序列并定位于胞質(zhì)中，遠(yuǎn)離了其自身的靶基因，進(jìn)而抑制了FOXO1因子對靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，并通過調(diào)節(jié)下游細(xì)胞周期及凋亡相關(guān)信號分子Bim、Bcl2、Bax等，影響細(xì)胞周期的進(jìn)程和凋亡事件。已有研究指出下調(diào)FOXO1能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，但其確切機(jī)制尚不清

4、楚。
　　目的：本實驗選取WI-38細(xì)胞（人成纖維細(xì)胞）與GIST-T1（胃間質(zhì)瘤細(xì)胞）作為研究對象。采用PI3K信號通路抑制劑LY294002和MAPK信號通路特異性抑制劑UO126單獨(dú)或聯(lián)合處理細(xì)胞，研究胃間質(zhì)瘤中FOXO1、p-FOXO1、Bcl2、Bax蛋白的表達(dá)，以及PI3K（磷脂酰肌醇-3-激酶）和MAPK（絲裂原活化蛋白激酶）信號通路對FOXO1的活性調(diào)節(jié)對胃間質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。研究胃間質(zhì)瘤中FOXO1、p-

5、FOXO1、Bcl2、Bax蛋白的表達(dá)，以及PI3K（磷脂酰肌醇-3-激酶）和MAPK（絲裂原活化蛋白激酶）信號通路對FOXO1的活性調(diào)節(jié)對胃間質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。
　　方法：采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色對GIST-T1細(xì)胞系進(jìn)行鑒定;Western blot檢測FOXO1、Bcl2、Bax蛋白在胃間質(zhì)瘤細(xì)胞系GIST-T1中的表達(dá)，以及PI3K信號通路抑制劑LY294002和MAPK信號通路特異性抑制劑UO126單獨(dú)或聯(lián)合處理細(xì)胞

6、后FOXO1、p-FOXO1、Bcl2、Bax等相關(guān)蛋白表達(dá)的變化;CCK-8法檢測其對細(xì)胞增殖的影響;免疫熒光法檢測FOXO1蛋白在GIST-T1細(xì)胞中的細(xì)胞定位的變化。流式細(xì)胞術(shù)檢測藥物作用后細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期變化。
　　結(jié)果：細(xì)胞c-kit免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果陽性。CCK-8結(jié)果顯示，LY294002和UO126單獨(dú)、聯(lián)合處理組GIST-T1細(xì)胞較DMSO組增殖明顯受到抑制(P＜0.05)，且呈時間依賴性。Western b

7、lot結(jié)果顯示，與對照組WI-38細(xì)胞（人成纖維細(xì)胞）相比，GIST-T1細(xì)胞中總FOXO1蛋白及Bax蛋白表達(dá)相對較低，p-FOXO1、Bcl2蛋白表達(dá)相對較高。LY294002和UO126單獨(dú)、聯(lián)合處理后，總FOXO1蛋白表達(dá)水平未見明顯變化(P＞0.05)，而p-FOXO1及Bcl2蛋白表達(dá)下降(P＜0.05)，Bax蛋白的表達(dá)增加(P＜0.05)。免疫熒光顯示藥物處理后FOXO1在GIST-T1細(xì)胞中的細(xì)胞核移位明顯增多。LY2

8、94002和UO126聯(lián)合處理GIST-T1細(xì)胞較藥物單獨(dú)應(yīng)用時蛋白表達(dá)變化及細(xì)胞定位變化均增加(P＜0.05)。流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)藥物處理組細(xì)胞凋亡明顯增加，細(xì)胞周期G1期細(xì)胞比例增加，S期細(xì)胞比例下降，且聯(lián)合用藥組作用效果更加顯著。
　　結(jié)論：培養(yǎng)的GIST-T1細(xì)胞c-kit免疫細(xì)胞化學(xué)染色陽性;PI3K和MAPK抑制劑能夠抑制胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞系GIST-T1細(xì)胞增殖。PI3K和MAPK抑制劑能夠通過調(diào)節(jié)FOXO1磷酸化，使