PEITC對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤LN229細(xì)胞凋亡影響及機(jī)制的研究.pdf

1、目的：
　　腫瘤的發(fā)生發(fā)展非常復(fù)雜，涉及到多個(gè)基因和多個(gè)通路的紊亂，在國(guó)際上已引起了科學(xué)家們的高度重視。盡管近年來(lái)國(guó)內(nèi)外在腫瘤的預(yù)防和治療研究方面取得了較大的進(jìn)展，但是惡性腫瘤造成的患者死亡率仍然很高，對(duì)腫瘤的預(yù)防和治療仍然是醫(yī)學(xué)科研界面對(duì)的一大難題。因此提高腫瘤的治愈率或減少腫瘤的死亡率是顯著研究的重點(diǎn)。目前微創(chuàng)治療和靶向抗腫瘤藥物治療是治療腫瘤的發(fā)展趨勢(shì)，特別是開發(fā)高效且低毒的靶向藥物。近年來(lái)，隨著越來(lái)越深入的研究，對(duì)癌癥的化

2、學(xué)預(yù)防方式備受關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，人們?nèi)粘Ｊ秤玫闹参锘蛩泻胸S富的抗腫瘤成分，如葡萄中含有漆樹黃酮，綠茶中含有茶多酚，以及十字花科植物中含有的異硫氰酸酯等。流行病學(xué)研究已經(jīng)表明，十字花科植物，如蘿卜、白菜、西蘭花、花椰菜以及芥菜等硫代葡萄糖苷含量都較高，當(dāng)植物組織或植物細(xì)胞遭到外力被破壞后，細(xì)胞內(nèi)的硫代葡萄糖苷會(huì)被細(xì)胞內(nèi)自身的黑芥子酶水解產(chǎn)生具有抗癌活性的異硫氰酸酯。因此，增加十字花科植物的攝取會(huì)很大程度降低癌癥的發(fā)生率。異硫氰酸酯是一

3、種具有強(qiáng)的刺激性氣味的物質(zhì)，而且容易揮發(fā)，容易溶于乙醚和乙醇等有機(jī)溶劑中，其穩(wěn)定性受環(huán)境酸堿度和溫度的影響較大。常見或研究較多的異硫氰酸酯類化合物包括苯乙基異硫氰酸酯(phenethylisothiocyanate，PEITC)、烯丙基異硫氰酸酯、萊菔硫烷以及萊菔素等。在比較異硫氰酸酯和腈類物質(zhì)的生物學(xué)活性時(shí)發(fā)現(xiàn)，異硫氰酸酯可以顯著的誘導(dǎo)Ⅱ型解毒酶的產(chǎn)生，而腈類物質(zhì)不能。
　　神經(jīng)膠質(zhì)瘤是一類中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的發(fā)生于人神經(jīng)上皮的

4、惡性腫瘤，其發(fā)病率、復(fù)發(fā)率和死亡率都較高，具有入侵快、治愈難和細(xì)胞異質(zhì)性的特點(diǎn)。神經(jīng)膠質(zhì)瘤在原發(fā)性腦腫瘤中的比例高達(dá)40％～60％，根據(jù)分化程度的不同分為星形細(xì)胞瘤、間變性星形細(xì)胞瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、髓母細(xì)胞瘤、室管膜瘤以及少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤等。神經(jīng)膠質(zhì)瘤分化成星形細(xì)胞瘤和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的患者，其1年內(nèi)的最大存活率僅為5％。由于神經(jīng)膠質(zhì)瘤具有分化能力差、侵襲能力強(qiáng)和增殖速率快等特點(diǎn)，常規(guī)采用的手術(shù)治療方法還不能徹底清除腫瘤細(xì)胞;另一方面，由于腫

5、瘤細(xì)胞對(duì)長(zhǎng)時(shí)間的輻射會(huì)產(chǎn)生耐受性從而導(dǎo)致殘余病灶的復(fù)發(fā)率高。此外，機(jī)體產(chǎn)生的腫瘤耐藥性和個(gè)體間的用藥差異性和腫瘤組織內(nèi)及周邊水腫組織間隙的靜水壓高等因素都會(huì)降低化療的效果。此外，由于手術(shù)治療惡性膠質(zhì)瘤特別是高分化的膠質(zhì)瘤細(xì)胞的局限性，其發(fā)生率和死亡率都較高，且術(shù)后平均生存時(shí)間少于一年。因此，如何將神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的完全清除仍然是研究者們面臨的一大難題，尋找新的治療方法至關(guān)重要。尋找能夠抑制被異常激活的神經(jīng)膠質(zhì)瘤信號(hào)通路的藥物是殺死腫瘤細(xì)胞

6、、抑制腫瘤細(xì)胞增殖，進(jìn)而治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤的有效手段之一。
　　近年來(lái)，隨著對(duì)異硫氰酸酯(isothiocyanates，ITCs)的深入研究，其顯著的抗癌活性備受研究者們關(guān)注，已成為預(yù)防癌癥發(fā)生發(fā)展的最具潛力的天然功能因子之一。目前已經(jīng)證明的具有抗腫瘤活性的異硫氰酸酯類化合物有二十余種。其中，蘿卜硫素(SFN，sulforaphane)可以抑制小鼠多種癌癥包括食道癌、胃癌、肝癌及膀胱癌的進(jìn)展;而由N-亞硝基甲基一芐基胺(NB MA)

7、、對(duì)由亞硝胺、苯并芘、甲基偶氮甲醇乙酸酯(MAM)、4-甲亞硝胺基-3-3吡啶-1-丁酮(NNK)等致癌物造成的小鼠肝癌、肺癌、腸道癌及食道癌會(huì)被苯甲基異硫氰酸酯(BITC，benzylisothiocyanate)和苯乙基異硫氰酸酯有效抑制。PEITC可顯著抑制吸煙造成的大鼠肺癌和食道癌的發(fā)生。目前公認(rèn)的異硫氰酸酯的抗癌和抗腫瘤活性是通過(guò)降低階段Ⅰ酶或提高階段Ⅱ解毒酶的活性，從而提高機(jī)體對(duì)致癌物的代謝能力和解毒、脫毒能力實(shí)現(xiàn)的。另外，

8、癌癥的發(fā)生發(fā)展與機(jī)體所受的氧化損傷程度也密切相關(guān)，具體表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)自由基含量的增加和相關(guān)氧化酶系的變化。苯乙基異硫氰酸酯是異硫氰酸酯家族成員之一，由于其具有顯著的化學(xué)預(yù)防作用而受到廣泛關(guān)注，是研究最廣泛的一種。多項(xiàng)研究已經(jīng)證實(shí)苯乙基異硫氰酸酯具有顯著的抗肺癌和白血病細(xì)胞等的活性。因此，苯乙基異硫氰酸酯將會(huì)是最具有臨床應(yīng)用前景的癌癥預(yù)防和治療的藥物之一。目前，美國(guó)安德森癌癥中心正在進(jìn)行使用苯乙基異硫氰酸酯治療肺癌和乳腺癌的Ⅰ期臨床試驗(yàn)（專

9、利號(hào):NCICN-55120）。同時(shí)，明尼蘇達(dá)州立大學(xué)和Masonic腫瘤研究中心聯(lián)合國(guó)家癌癥中心也在展開苯乙基異硫氰酸酯治療肺癌的Ⅱ期臨床試驗(yàn)。本研究旨在探索苯乙基異硫氰酸酯對(duì)人類神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞LN229的生長(zhǎng)影響極其影響機(jī)制，為將苯乙基異硫氰酸酯應(yīng)用到預(yù)防和治療人神經(jīng)膠質(zhì)瘤提供依據(jù)。
　　方法：
　　本研究的研究對(duì)象是人神經(jīng)膠質(zhì)瘤LN229細(xì)胞，利用MTT試驗(yàn)檢測(cè)PEITC對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖的影響。MTT是一種黃色染

10、料。在細(xì)胞線粒體內(nèi)含有的琥珀酸脫氫酶和細(xì)胞色素C的共同作用下，MTT被代謝還原為藍(lán)紫色且不溶于水的甲臜，通過(guò)測(cè)定490 nm處甲臜的含量就可推測(cè)活細(xì)胞的數(shù)量。通過(guò)Annexin-Ⅴ-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)分析PEITC對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響。Annexin-Ⅴ是一種依賴于Ca2+的磷脂結(jié)合蛋白，當(dāng)在Ca2+存在條件下，Annexin-Ⅴ可以與細(xì)胞表面的磷脂酰絲氨酸結(jié)合，使磷脂酰絲氨酸暴露在細(xì)胞膜外標(biāo)志著細(xì)胞凋亡的開始;P

11、I是一種DNA染料，當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入凋亡晚期后，細(xì)胞膜的通透性會(huì)發(fā)生變化，此時(shí)PI進(jìn)入細(xì)胞并與細(xì)胞內(nèi)的DNA結(jié)合，因此，通過(guò)Annexin-Ⅴ/PI雙染色法就可以檢測(cè)到細(xì)胞凋亡，分析細(xì)胞內(nèi)的DNA含量的不同研究細(xì)胞周期的變化。利用DCFH-DA探針?lè)z測(cè)腫瘤細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactiveoxygen species，ROS)和谷胱甘肽(glutathione，GSH)的表達(dá)水平。DCFH-DA探針是用于特異的鑒定細(xì)胞內(nèi)ROS含量，其可以穿過(guò)細(xì)

12、胞膜并被酯酶催化水解形成DCFH，而細(xì)胞內(nèi)的ROS可以將無(wú)熒光標(biāo)記的DCFH轉(zhuǎn)變?yōu)橛袩晒鈽?biāo)記的DCF。所以，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)DCF的熒光強(qiáng)度就可以鑒定細(xì)胞內(nèi)ROS的水平變化。同時(shí)通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測(cè)用PEITC處理后，腫瘤細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)的活性。采用western blot法檢測(cè)含半胱氨酸的天冬氨酸

13、酪蛋白水解酶-3（cysteinyl aspartate specific proteinase-3，Caspase-3）活性的變化。
　　結(jié)果：
　　當(dāng)PEITC作用于神經(jīng)膠質(zhì)瘤LN229細(xì)胞72小時(shí)后，細(xì)胞的生長(zhǎng)受到顯著抑制，且這種抑制作用具有PEITC濃度依賴性(IC50=20μM)。結(jié)果還顯示，當(dāng)濃度分別為10μM和20μM的PEITC時(shí)，PEITC對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率較高，而且對(duì)正常細(xì)胞表現(xiàn)出無(wú)毒或弱毒性。因此，在接

14、下來(lái)的研究中本文選擇的PEITC濃度分別為10μM和20μM。流式細(xì)胞術(shù)分析PEITC對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤LN229細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果顯示:分別用10μM和20μM的PEITC處理LN229細(xì)胞24小時(shí)后，對(duì)照組的細(xì)胞凋亡率僅為5％;10μM的PEITC處理后細(xì)胞凋亡率為30.3％(P＜0.05);而20μM的PEITC處理后細(xì)胞凋亡率高達(dá)64.9％(P＜0.05)。同時(shí)，流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果還顯示處于G2/M期的細(xì)胞比例明顯上升，而G0/G1

15、期的細(xì)胞比例明顯下降(P＜0.05)。對(duì)ROS表達(dá)水平的檢測(cè)結(jié)果顯示10μMPEITC組細(xì)胞的ROS表達(dá)量比對(duì)照組高4倍，而20μM PEITC組細(xì)胞的ROS表達(dá)量比對(duì)照組高6倍，且統(tǒng)計(jì)分析具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。此外，用10μM和20μM的PEITC分別處理LN229細(xì)胞24小時(shí)后，腫瘤細(xì)胞內(nèi)GSH和SOD的表達(dá)水平明顯降低。10μM PEITC組和20μM PEITC組細(xì)胞內(nèi)的GSH表達(dá)量與對(duì)照組細(xì)胞GSH表達(dá)量相比僅為69

16、.3％和42.4％(P＜0.05);而10μM PEITC組和20μM PEITC組細(xì)胞內(nèi)的SOD表達(dá)量與對(duì)照組細(xì)胞SOD表達(dá)量相比僅為60.7％和20.6％(P＜0.05);而且腫瘤細(xì)胞內(nèi)caspase-3的活性與對(duì)照組(β-actin)相比顯著增加(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　PEITC具有抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞LN229生長(zhǎng)、促進(jìn)凋亡以及阻滯細(xì)胞周期的功能;而且PEITC顯著增加腫瘤細(xì)胞內(nèi)的ROS水平，并抑制SOD和