大鼠骨髓間充質干細胞（MSCs）移植治療實驗性大鼠股動脈閉塞癥的研究.pdf

1、目的：探討骨髓間充質干細胞(MSCs)利用特定的誘導劑誘導分化為血管內皮細胞及MSCs單獨或與必要的誘導因子組合移植治療實驗性大鼠股動脈閉塞癥，為臨床應用間充質干細胞移植治療糖尿病足等血管閉塞性疾病提供實驗依據(jù)。 方法： 1．大鼠間充質于細胞(MSCs)的分離培養(yǎng)、擴增與鑒定：選取健康0.2kg左右Wistar大鼠一只，麻醉后在無菌的條件下取股骨和脛骨，骨剪剪斷關節(jié)處，用無血清DMEM沖出骨髓腔中的細胞后，用淋巴細胞分離

2、液(比重1.077g/ml)密度梯度離心法分離單個核細胞(MNC)，以含10﹪胎牛血清DMEM培養(yǎng)基洗滌2次，以1×10<'7>cells/cm<'2>密度接種于培養(yǎng)瓶孵育。2天后半量換液，4天時完全換液，棄去未貼壁細胞，貼壁細胞繼續(xù)培養(yǎng)，以后每2～3天換液1次，10天后當細胞融合時，用胰蛋白酶消化傳代。定期觀察細胞的生長情況，細胞傳至第4代后用流式細胞儀分析CD34、CD29的表達情況。 2．MsCs誘導分化：選取狀態(tài)較穩(wěn)定的

3、第4代細胞，分別用含10﹪胎牛血清和2﹪胎牛血清的誘導液(終濃度為10ng/mlVEGF、2ng/mlbFGF的DMEM培養(yǎng)液)繼續(xù)培養(yǎng)，每3～4天換液一次，細胞融合時，胰蛋白酶消化傳代，于第7、14天用流式細胞儀分析CD34的表達情況，免疫組化法觀察FVⅢ的表達情況。 3．MSCs移植治療實驗性大鼠股動脈閉塞癥：選取0.2kg左右Wistar大鼠20只，其中的2只取雙下肢股四頭肌和腓長肌做HE染色作為正常肌肉對照，剩余的18只

4、結扎并斷離雙側股動脈，復制成大鼠股動脈閉塞癥模型。模型中的6只大鼠分別在左側后肢局部缺血肌肉(股四頭肌和腓長肌)通過多點注射的方法注射A液(生理鹽水)1 ml(A組)，按同樣的方法右側注射B液(培養(yǎng)擴增后BrdU標記的1×10<'6>cells/ml的MSCs懸液)1 ml(B組)；按同樣方法另外6只大鼠分別在左側注射C液(培養(yǎng)擴增后BrdU標記的1×10<'6>cells/ml的MSCs與100ng/mlVEGF+100ng/mlbF

5、GF誘導因子懸液)1ml(C組)，右側注射A液1ml(A組)；最后6只大鼠左側注射B液1ml(B組)，右側注射C液1ml(C組)。分別在移植的第7、14天處死大鼠，取雙下肢缺血部位肌肉做HE染色、免疫組織化學(FVⅢ、BrQU)檢測。 結果： 1．MSCs的分離培養(yǎng)、擴增與鑒定：細胞接種4d后首次完全換液，棄去未貼壁的細胞，貼壁的細胞即為MSCs，此細胞形態(tài)長梭形，類似成纖維細胞，呈團、簇狀分布。10d時細胞貼滿瓶底，此

6、時呈魚群樣、漩渦狀、輻射狀或網(wǎng)狀排列。傳代后細胞增殖迅速，一般2～3天可傳一代。流式細胞術分析MSCs結果顯示，CD34陽性率為1.01±0.56﹪、CD29陽性率為97.32±2.77﹪。 2．兩種誘導液誘導效果的比較：10﹪胎牛血清誘導體系，14d后免疫組織化學法檢測FVⅢ的表達，細胞的陽性率為12.21±2.32﹪；而2﹪胎牛血清誘導體系， 14d后檢測FVⅢ的表達，細胞的陽性率為91.43±6.32﹪，后者明顯高于前者(

7、p<0.01)。 3.血管內皮細胞的鑒定：經2﹪胎牛血清誘導體系誘導的MSCs分別于第7d、14d用流式細胞術和免疫組織化學法分析CD34和FVⅢ的表達情況，結果見表1。誘導后CD34和FVⅢ陽性的細胞仍呈長梭形，但順應性增加，呈鋪路石樣排列。表1．不同誘導時間CD34和FVⅢ的表達情況4．MSCs單獨或與必要的誘導因子組合血管再生作用比較：(1) 移植后7d免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，血管壁周圍B組和C組有BrdU陽性的血管內皮細胞，而

8、A組無此細胞。(2) 移植后14d免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，肌束間B組、C組有BrdU陽性的血管，而A組無BrdU陽性的血管。(3) 平均每視野FVⅢ染色陽性的血管數(shù)目：A組為2.8±0.6個/HP，B組為8.4±2.3個/HP，C組為12.6±2.9個/HP：B組明顯高于A組(p<0.01)，C組明顯高于B組(p<0.05)。 結論： 1．骨髓間充質干細胞可以向血管內皮細胞方向分化，說明骨髓間充質干細胞具有向本胚層縱向分化的潛