狼毒乙素和新狼毒素A的藥物代謝及動力學(xué)研究.pdf

1、狼毒為傳統(tǒng)草藥,在我國臨床使用已有非常悠久的歷史,廣泛用于治療水腫、惡性腫瘤、白血病、慢性氣管炎、皮膚病、婦科病、肺結(jié)核、腸結(jié)核、淋巴結(jié)核等癥。狼毒乙素(ECB)的化學(xué)名為2,4-dihydroxy-6-methoxy-3-methyl-acetophenone,新狼毒素A(NCA)的化學(xué)名為(2S,2’S,3S,3’S)-5,5’,7,7’-tetrahydroxy-2,2’-bis(4-hydroxyphenyl)-3,3’-bic

2、hroman-4,4’-dione。二者都是中藥狼毒的主要有效成分,藥理活性已有些報道。藥理學(xué)研究表明狼毒乙素對耐藥型和非耐藥型結(jié)核桿菌具有明顯抑制作用,是已上市藥物結(jié)核靈片的主要有效成分之一。2,4-dihydroxy-6-methoxyl-methylene-3-methyl-acetophenone,一種狼毒乙素的結(jié)構(gòu)類似物,最近被報導(dǎo)具強抗人宮頸癌細(xì)胞(Hela-60)活性,IC50值為95ng/mL。體外實驗表明,新狼毒素A具

3、有明顯的抗前列腺癌細(xì)胞(LNCaP)活性。而狼毒乙素和新狼毒素A的藥物代謝和動力學(xué)(DM/PK)至今尚未見研究。本文先從狼毒大戟與瑞香狼毒根中分離、制備狼毒乙素和新狼毒素A,再采用各種體內(nèi)外實驗?zāi)Ｐ蛯嵌疽宜睾托吕嵌舅谹的吸收、轉(zhuǎn)運、代謝、排泄與動力學(xué)的性質(zhì)進(jìn)行了較系統(tǒng)的研究。本文的研究結(jié)果可為狼毒的臨床應(yīng)用及相關(guān)的新藥研發(fā)提供理論和實驗依據(jù)。1、新狼毒素A在MDCK和MDCK-MDR1細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運研究新狼毒素A在MDCK和MDCK-M

4、DR1細(xì)胞上的轉(zhuǎn)運實驗表明,新狼毒素A在這兩種細(xì)胞中的表觀滲透系數(shù)均≤1×10-6cm/s,提示其口服后生物利用度較低。新狼毒素A在MDCK-MDR1細(xì)胞單層中的轉(zhuǎn)運存在顯著的外排現(xiàn)象,并可被P-糖蛋白(P-gp)的經(jīng)典抑制劑維拉帕米所抑制,表明P-gp參與了新狼毒素A在MDCK-MDR1細(xì)胞中的外排轉(zhuǎn)運,提示外排轉(zhuǎn)運蛋白P-gp可能是制約其口服生物利用度的主要生理屏障因素之一。以羅丹明123(R123)作為P-gp的探針底物,評價新狼

5、毒素A對P-gp轉(zhuǎn)運功能的影響,結(jié)果表明100μmol/L的新狼毒素A對MDCK-MDR1細(xì)胞單層中由P-gp介導(dǎo)的R123外排有顯著的抑制作用,提示新狼毒素A可能為P-gp抑制劑。另一方面,新狼毒素A對MDCK細(xì)胞具有比較明顯的細(xì)胞毒性,但對MDCK-MDR1細(xì)胞的毒性顯著減弱,可能是MDCK-MDR1細(xì)胞中高表達(dá)的外排蛋白P-gp參與了藥物的外排,減少細(xì)胞內(nèi)的蓄積,使毒性下降,也間接驗證了新狼毒素A是P-gp底物的實驗結(jié)果。2、狼毒

6、乙素和新狼毒素A在大鼠肝微粒體和大鼠原代肝細(xì)胞中的代謝研究在β-NADPH存在下,狼毒乙素在大鼠肝微粒體中生成一個氧化代謝產(chǎn)物,質(zhì)譜鑒定其結(jié)構(gòu)是1-(2,4-dihydroxy-6-methoxy-3-methylphenyl)-2-hydroxyethanone,為單羥基化代謝物;在UDPGA存在下,狼毒乙素在大鼠肝微粒體中生成一個單取代葡萄糖醛酸苷,分離后經(jīng)p-葡萄糖醛酸苷水解酶水解、質(zhì)譜分析、核磁共振氫譜鑒定其結(jié)構(gòu)為2-hydro

7、xy-6-methoxy-3-methyl-acetophenone-4-O-β-glucuronide。孵育體系中同時加入β-NADPH和尿苷二磷酸葡萄糖醛酸(UDPGA)進(jìn)行一相、二相級聯(lián)代謝共孵育,結(jié)果超過80％的狼毒乙素均轉(zhuǎn)化成單取代葡萄糖醛酸苷,提示狼毒乙素在大鼠體內(nèi)主要經(jīng)葡萄糖醛酸化代謝。新狼毒素A在大鼠肝微粒體中不發(fā)生氧化代謝,但在UDPGA存在下生成兩個代謝產(chǎn)物,經(jīng)葡萄糖醛酸苷水解酶水解和質(zhì)譜分析,這兩個代謝物均為單取代

8、葡萄糖醛酸苷。狼毒乙素和新狼毒素A在大鼠肝微粒體中發(fā)生的葡萄糖醛酸化代謝及狼毒乙素發(fā)生的氧化代謝均符合米氏動力學(xué)方程。綜合應(yīng)用選擇性化學(xué)誘導(dǎo)和抑制實驗,進(jìn)行篩選,大鼠肝微粒體中催化狼毒乙素代謝的酶主要是CYP3A, CYP2C11, CYP2C6和UGT1A6/9,其中UGT1A6的貢獻(xiàn)更為顯著;催化新狼毒素A葡萄糖醛酸化代謝的酶主要是UGT1A3/6/9。將新狼毒素A與大鼠原代肝細(xì)胞共孵育,沒檢測到代謝產(chǎn)物;將狼毒乙素與大鼠原代肝細(xì)胞

9、共孵育,檢測有痕量的兩個代謝物,但相對肝微粒體,原代肝細(xì)胞的代謝活性要低很多。3、狼毒乙素和新狼毒素A的大鼠體內(nèi)代謝、排泄和動力學(xué)研究狼毒乙素與新狼毒素A大鼠體內(nèi)主要發(fā)生葡萄糖醛酸化代謝,代謝物分析均只檢測到一個葡萄糖醛酸苷。狼毒乙素體內(nèi)產(chǎn)生的葡萄糖醛酸苷跟體外產(chǎn)生的葡萄糖醛酸苷結(jié)構(gòu)一致。從色譜保留時間判斷,新狼毒素A體內(nèi)產(chǎn)生的葡萄糖醛酸苷跟體外鼠肝微粒體產(chǎn)生的兩個中的一個相對應(yīng),結(jié)構(gòu)還在鑒定中。對大鼠口服狼毒乙素的動力學(xué)行為進(jìn)行了初步

10、研究,建立了血漿中狼毒乙素葡萄糖醛酸苷測定的UPLC-MS方法。結(jié)果顯示,大鼠口服狼毒乙素后,在血漿中只明顯檢測到其單取代葡萄糖醛酸苷。該葡萄糖醛酸苷在大鼠體內(nèi)的動力學(xué)行為符合二室模型,達(dá)峰時間約為4小時,提示大鼠口服狼毒乙素后吸收迅速。大鼠口服新狼毒素A后,血漿中沒有檢測到明顯的代謝產(chǎn)物,原形藥物的濃度也非常低,提示大鼠口服新狼毒素A的吸收很差,這與新狼毒素A是P-gp底物有關(guān)。4、狼毒乙素和新狼毒素A在人肝微粒體、HepG2細(xì)胞及人

11、重組酶中的代謝研究狼毒乙素在人肝微粒體中的代謝結(jié)果與鼠肝微粒體中的一致,提示狼毒乙素在人體內(nèi)主要發(fā)生葡萄糖醛酸化代謝。新狼毒素A在人肝微粒體中只生成了一個單取代葡萄糖醛酸苷。綜合選擇性化學(xué)抑制及人重組酶實驗對這兩個底物的代謝活性分析結(jié)果,可推測人肝微粒體中參與狼毒乙素代謝的主要酶系是UGT1A6/9、CYP3A4、CYP2C9,其中最主要的是CYP3A4與UGT1A6;參與新狼毒素A代謝的主要酶系是UGT1A3/6/9。狼毒乙素與Hep