EGCG對(duì)染鎘APP-PS1小鼠Aβ影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是主要發(fā)生在老年人的一種以進(jìn)行性癡呆為臨床特征的神經(jīng)退行性疾病。隨著人口的逐漸老齡化，AD的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，給社會(huì)和家庭帶來了沉重的負(fù)擔(dān)，由于缺乏有效的治療手段，AD已成為危害人類健康的主要致死性疾病之一。AD的典型病理特征包括：β-淀粉樣蛋白(β-amyloid，Aβ)在腦內(nèi)病理性沉積形成老年斑、神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles，NFT)和

2、神經(jīng)元凋亡等。Aβ是AD發(fā)生和發(fā)展的中心環(huán)節(jié)，體內(nèi)的Aβ由β-淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)經(jīng)β-和γ-分泌酶水解而成。到目前為止，AD的具體發(fā)病機(jī)制還不是十分清楚，但越來越多的證據(jù)表明，鋅離子在AD的發(fā)病和病理過程中起著關(guān)鍵性的作用。鋅離子能夠通過鏈接相鄰Aβ分子的第13位上的組氨酸而導(dǎo)致Aβ聚集。因此，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外金屬離子穩(wěn)態(tài)，維持Aβ生成與降解的動(dòng)態(tài)平衡，已經(jīng)成為目前AD治療學(xué)的一個(gè)重

3、要策略。
　　 鎘(Cd)是一種對(duì)人體有害的微量元素，目前已有許多有關(guān)鎘引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)形態(tài)和生化異常以及導(dǎo)致記憶減退、智力發(fā)育低下等的報(bào)道。鎘是鋅的一種抗代謝物，鎘與鋅是相互拮抗的微量元素，在體內(nèi)有一定的比值，如鎘升高或鋅降低，則Cd/Zn比值升高[9]。Zn2+和Cd2+是代謝上互相拮抗的兩種二價(jià)金屬離子，可競爭性地與同一酶或蛋白質(zhì)結(jié)合，它們?cè)隗w內(nèi)的濃度呈負(fù)相關(guān)。因此，本實(shí)驗(yàn)擬通過鎘對(duì)APP/PS1小鼠的染鎘干預(yù)，

4、探討其對(duì)腦內(nèi)Ap產(chǎn)生的影響。
　　 表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)是茶葉的主要活性成分，已有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)EGCG可使產(chǎn)生非淀粉樣變性的可溶性APP(sAPP)的表達(dá)水平提高，減少了具有神經(jīng)毒性作用的Aβ的產(chǎn)生，而且也使產(chǎn)生可溶性淀粉樣蛋白的a-分泌酶的活性提高了32％。故本研究擬采用EGCG作為干預(yù)藥物，擬采用AD轉(zhuǎn)基因小鼠模型，應(yīng)用行為學(xué)、形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)等手段，觀察EGCG對(duì)染鎘APP/PS1小鼠Ap的影響，探討EGCG

5、對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用及其機(jī)制，為進(jìn)一步將EGCG在神經(jīng)退行性疾病治療中的應(yīng)用提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 迄今AD發(fā)生機(jī)理的研究主要聚集在Aβ的產(chǎn)生過程，包括對(duì)相關(guān)的APP，α、β、γ各類分泌酶，PS的活性及結(jié)構(gòu)異常等的研究，而對(duì)Aβ的降解機(jī)制了解甚少。正常人Aβ的合成和降解兩條途徑相互平衡，體內(nèi)Aβ呈穩(wěn)定的低水平。中性內(nèi)肽酶(neutral endopeptidase，NEP)是Aβ最主要的降解酶，大量研究證明了NEP水平和Aβ病

6、理沉積呈負(fù)相關(guān)，因此，本研究擬在上述觀察基礎(chǔ)上，采用WesternBlot檢測技術(shù)觀察鎘和EGCG對(duì)AD小鼠APP的影響；對(duì)α分泌酶(ADAM10)的影響；對(duì)β分泌酶(BACE-1)的影響；對(duì)APP的代謝產(chǎn)物sAPPα的影響和對(duì)Aβ的降解酶NEP的影響，為探討AD發(fā)病機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 實(shí)驗(yàn)方法
　　 本實(shí)驗(yàn)采用雙轉(zhuǎn)染APP695swe基因和人早老素(presenilin，PS-1)突變基因的AD模型小鼠(APP/

7、PS1小鼠)為研究對(duì)象，隨機(jī)分為對(duì)照組，Cd組，Cd+EGCG組三組，應(yīng)用Morris水迷宮檢測APP/PS1小鼠行為學(xué)改變，應(yīng)用免疫組化法檢測各組鼠腦內(nèi)老年斑的形態(tài)學(xué)變化，應(yīng)用ELISA技術(shù)檢測Aβ的定量改變，應(yīng)用浸入式金屬自顯影技術(shù)(autometallography，AMG)檢測APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)鋅含量的變化，應(yīng)用Western Blot技術(shù)檢測APP/PS1小鼠大腦皮層和海馬α分泌酶、sAPPα、β分泌酶、APP和NE

8、P的蛋白表達(dá)變化。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　 1、Morris水迷宮試驗(yàn)結(jié)果：定位航行試驗(yàn)中，對(duì)照組、Cd+EGCG組、Cd組三組小鼠搜索平臺(tái)的潛伏期呈逐漸下降趨勢。對(duì)照組小鼠和Cd+EGCG組小鼠的運(yùn)動(dòng)軌跡主要集中在相應(yīng)平臺(tái)位置，而Cd組小鼠多沿池壁及遠(yuǎn)離相應(yīng)平臺(tái)位置運(yùn)動(dòng)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，Cd組APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠與正常組相比，搜索平臺(tái)的潛伏期和搜索路程明顯延長，穿越平臺(tái)位置的次數(shù)減少，具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*P<0.0

9、1)。Cd+EGCG組與Cd組APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠相比，上述指標(biāo)均有不同程度的改善，具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＃P<0.01)。表明Cd+EGCG組小鼠的空間學(xué)習(xí)能力得到改善。
　　 2、免疫組化檢測結(jié)果：Cd組小鼠大腦皮質(zhì)及海馬等區(qū)域出現(xiàn)的陽性斑塊(SP)個(gè)數(shù)及大小與對(duì)照組相比均顯著降低(*P<0.01)，說明Cd可影響小鼠腦組織神經(jīng)元Aβ的沉積，而Cd+EGCG組小鼠腦內(nèi)的SP體積及數(shù)量均有所改善(＃P<0.01)。

10、　　 3、ELISA檢測結(jié)果：Cd組小鼠Aβ1-42含量與對(duì)照組相比明顯增多(*P<0.01)；Cd+EGCG組小鼠Aβ1-42含量與Cd組小鼠相比有一定程度降低(＃P<0.01)。
　　 4、AMG檢測結(jié)果：Cd組游離鋅離子較對(duì)照組增多(*P<0.01)；Cd+EGCG組小鼠游離鋅離子較Cd組降低(＃P<0.01)。
　　 5、Western Blot檢測結(jié)果：Cd可以下調(diào)ADAM10、SAPPa和NEP的蛋白表達(dá)；

11、上調(diào)BACE-1和APP的蛋白表達(dá)；EGCG可以上調(diào)ADAM10、sAPPα、NEP蛋白表達(dá)；下調(diào)BACE-1和APP蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)論
　　 1、Cd可加速APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織神經(jīng)元Aβ的沉積，使可溶性Aβ1-42含量增加，游離鋅離子增多，從而加重小鼠的行為學(xué)異常。
　　 2、EGCG能明顯改善小鼠腦內(nèi)的SP體積及數(shù)量，可下調(diào)可溶性Aβ1-42含量，可降低小鼠游離鋅離子濃度。能明顯改善APP/PS