AP-2α表達(dá)降低引起EGF receptor過表達(dá)以及SW480細(xì)胞體外惡性增殖與侵襲能力增強(qiáng).pdf

1、目的： 轉(zhuǎn)錄因子AP-2α(Transcription factor activator protein-2α)屬于轉(zhuǎn)錄因子AP-2(Transcription factor activator protein-2，AP-2)家族，是一種特異性DNA結(jié)合蛋白，分子量約為52kD。AP-2α作為一種特異性核轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控多種靶基因的表達(dá)，參與調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育以及細(xì)胞的生長分化。國外研究發(fā)現(xiàn)，AP-2α在多種腫瘤包括結(jié)直腸癌中表達(dá)降低或缺

2、失，提示AP-2α在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中起著腫瘤抑制基因的作用。本研究進(jìn)一步探討AP-2α的表達(dá)降低或缺失參與結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的作用機(jī)制。 方法： 本研究采用基因工程技術(shù)，以pcDNA3.1(+)為表達(dá)載體，構(gòu)建了攜帶野生型AP-2α基因的pcDNA3.1(+)-hAP-2α真核表達(dá)質(zhì)粒；在脂質(zhì)體介導(dǎo)下將pcDNA3.1(+)-hAP-2α和pcDNA3.1(+)分別轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌細(xì)胞株-SW480細(xì)胞，利用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)

3、(RT-PCR)、Western blot分析與凝膠遷移率變動分析(EMSA)對AP-2α在SW480細(xì)胞中的表達(dá)及其活性進(jìn)行鑒定；利用MTT法和軟瓊脂克隆形成試驗(yàn)體外觀察AP-2α對SW480細(xì)胞惡性增殖能力的影響；利用Transwell侵襲試驗(yàn)體外觀察AP-2α對SW480細(xì)胞侵襲能力的影響。 利用PCR技術(shù)從SW480細(xì)胞基因組DNA中擴(kuò)增表皮生長因子受體(Epidermal growthfactor receptor,E

4、GF receptor)基因啟動子，將其構(gòu)建入pMD-18T載體，并進(jìn)行測序；根據(jù)該段啟動子區(qū)域中5個(gè)可能的AP-2α結(jié)合位點(diǎn)設(shè)計(jì)5對寡核苷酸探針，利用EMSA技術(shù)體外水平檢測各組細(xì)胞的核蛋白與這5對寡核苷酸探針的結(jié)合情況；進(jìn)一步利用RT-PCR技術(shù)和Western blot分析檢測轉(zhuǎn)染AP-2α基因后SW480細(xì)胞中內(nèi)源性EGF receptor基因的表達(dá)。 結(jié)果： 成功構(gòu)建攜帶野生型AP-2α基因的pcDNA3.1(

5、+)-hAP-2α真核表達(dá)質(zhì)粒；野生型AP-2α基因在人結(jié)腸癌細(xì)胞株-SW480細(xì)胞中獲得高水平表達(dá)，并且表達(dá)的AP-2α蛋白具有較強(qiáng)的DNA結(jié)合活性；MTT結(jié)果提示轉(zhuǎn)染AP-2α基因后SW480細(xì)胞增殖趨緩，軟瓊脂克隆體積小且數(shù)量少，細(xì)胞侵襲能力下降。 成功擴(kuò)增SW480細(xì)胞基因組DNA中EGF receptor基因的啟動子區(qū)域，并構(gòu)建入pMD-18T載體，測序結(jié)果顯示該段啟動子區(qū)域未發(fā)現(xiàn)有任何可能導(dǎo)致反式作用因子結(jié)合能力異常

6、的基因缺失、重排或者突變；EMSA結(jié)果顯示，SW480細(xì)胞中表達(dá)的AP-2α蛋白與3對探針發(fā)生特異性結(jié)合，且結(jié)合強(qiáng)度不等；轉(zhuǎn)染AP-2α基因后，SW480細(xì)胞中內(nèi)源性EGFreceptor mRNA含量和蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)。 結(jié)論： 轉(zhuǎn)錄因子AP-2α可以抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞株-SW480細(xì)胞體外惡性增殖以及侵襲能力，其作用機(jī)制可能與通過直接作用于EGF receptor基因啟動子區(qū)域從而下調(diào)內(nèi)源性EGF receptor