DADS對uPAR高表達(dá)SW480細(xì)胞遷移侵襲的影響.pdf

1、目的：二烯丙基二硫（DADS）是大蒜中的主要有效成分，具有很高的開發(fā)潛力。我們之前工作證實，DADS能在體內(nèi)外抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞增殖與遷移侵襲。尿激酶型纖溶酶原激活物受體(uPAR)與腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移及 EMT密切相關(guān)，阻斷uPAR信號傳導(dǎo)通路可逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞EMT、抑制腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。迄今，鮮有DADS抑制腫瘤細(xì)胞EMT及侵襲轉(zhuǎn)移作用的相關(guān)報道。本課題在前期研究的基礎(chǔ)上，通過構(gòu)建uPAR高表達(dá)的SW480細(xì)胞系，研究DADS下調(diào)uPAR

2、信號通路介導(dǎo)抑制人結(jié)腸細(xì)胞EMT與遷移侵襲，證實DADS在對腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移和EMT的抑制過程中，uPAR起到關(guān)鍵性作用，對DADS進(jìn)行臨床應(yīng)用開發(fā)，提供實驗依據(jù)。
　　方法：pIRES2-EGFP-uPAR真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞，構(gòu)建穩(wěn)定uPAR高表達(dá)SW480細(xì)胞系。Transwell侵襲實驗與劃痕實驗檢測DADS對uPAR高表達(dá)SW480細(xì)胞遷移侵襲的作用。RT-PCR和Western blot檢測DADS對uPAR高表

3、達(dá)SW480細(xì)胞EMT及uPAR相關(guān)信號分子的影響。裸鼠移植瘤實驗檢測DADS對uPAR高表達(dá)SW480細(xì)胞移植瘤生長的作用。
　　結(jié)果：
　　1.成功建立穩(wěn)定uPAR高表達(dá)的SW480細(xì)胞。
　　將pIRES2-EGFP和pIRES2-EGFP-uPAR真核表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞，通過熒光顯微鏡，可以觀察到綠色熒光，證明 pIRES2-EGFP/uPAR和pIRES2-EGFP已經(jīng)導(dǎo)入到SW480細(xì)胞當(dāng)中。R

4、T-PCR與 Western blot顯示，uPAR/SW480細(xì)胞uPAR mRNA和蛋白均具有較高的表達(dá)量，表明建立穩(wěn)定uPAR高表達(dá)的SW480細(xì)胞。
　　2. DADS對uPAR高表達(dá)SW480細(xì)胞遷移的影響。
　　劃痕實驗顯示，uPAR高表達(dá)細(xì)胞的遷移距離明顯大于SW480細(xì)胞(P<0.05)。DADS處理后，空載體細(xì)胞的遷移距離明顯低于SW480細(xì)胞和uPAR高表達(dá)細(xì)胞(P<0.05)。uPAR高表達(dá)細(xì)胞的遷移距

5、離明顯低于DADS處理前(P<0.05)。表明uPAR高表達(dá)增強(qiáng)SW480細(xì)胞的遷移能力，DADS可抑制uPAR高表達(dá)SW480細(xì)胞的遷移。
　　3. DADS對uPAR高表達(dá)SW480細(xì)胞侵襲的影響。
　　侵襲實驗顯示，uPAR高表達(dá)組穿膜細(xì)胞較 SW480組明顯增加(P<0.05)。DADS作用24h后，空載體細(xì)胞穿膜細(xì)胞明顯少于SW480組與uPAR高表達(dá)組(P<0.05)。uPAR高表達(dá)組較處理前穿膜細(xì)胞顯著減少(P

6、<0.05)。表明DADS可抑制uPAR高表達(dá)SW480細(xì)胞的侵襲能力，uPAR高表達(dá)可增強(qiáng)侵襲作用。
　　4. DADS對uPAR高表達(dá)SW480細(xì)胞EMT的影響
　　RT-PCR和Western blot顯示，uPAR高表達(dá)組vimentin表達(dá)較SW480細(xì)胞明顯上調(diào)，E-cadherin顯著下調(diào)(P<0.05)。DADS作用后，空載體細(xì)胞vimentin表達(dá)較SW480細(xì)胞與uPAR高表達(dá)組明顯下調(diào)和E-cadher

7、in顯著上調(diào)(P<0.05)，uPAR高表達(dá)組較處理前 vimentin明顯下調(diào)與 E-cadherin上調(diào)(P<0.05)。表明uPAR高表達(dá)可促進(jìn)EMT，DADS通過下調(diào)uPAR高表達(dá)SW480細(xì)胞vimentin與上調(diào)E-cadherin表達(dá)抑制EMT。
　　5. DADS對uPAR相關(guān)分子的影響。
　　RT-PCR和Western blot顯示，uPAR高表達(dá)組uPAR、uPA與MMP-9較SW480細(xì)胞明顯上調(diào)(P

8、<0.05)。DADS作用后，空載體細(xì)胞uPAR、uPA與MMP-9表達(dá)較SW480細(xì)胞與uPAR高表達(dá)組明顯下調(diào)(P<0.05)，uPAR高表達(dá)組較處理前uPAR、uPA與MMP-9明顯下調(diào)(P<0.05)。
　　6. DADS與uPAR高表達(dá)對裸鼠成瘤能力的影響。
　　裸鼠實驗表明，DADS處理組與相應(yīng)未處理組比較，腫瘤生長速度明顯減慢(P<0.05)，uPAR高表達(dá)組較SW480組移植瘤生長明顯增快(P<0.05)。D

9、ADS處理組的瘤重較相應(yīng)未處理組顯著性減少(P<0.05)，uPAR高表達(dá)組明顯重于SW480組(P<0.05)。DADS處理組較未處理組與uPAR高表達(dá)組移植瘤細(xì)胞異型性降低。DADS處理后E-cadherin陽性表達(dá)明顯增強(qiáng)，Vimentin、Ki-67、CD34陽性表達(dá)明顯降低；uPAR高表達(dá)組的Ki-67、CD34、Vimentin陽性表達(dá)均明顯增強(qiáng)，E-cadherin陽性表達(dá)明顯降低。
　　結(jié)論：
　　1. uP