PRDX2對人結(jié)直腸癌細胞株SW480侵襲轉(zhuǎn)移的影響及相關機制研究.pdf

1、目的：通過Peroxiredoxin2（PRDX2）基因沉默和過表達慢病毒載體轉(zhuǎn)染結(jié)直腸癌SW480細胞，獲取PRDX2基因沉默和過表達穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株，探討PRDX2在人結(jié)直腸癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學特性中發(fā)揮的作用；利用TGF-β1誘導人結(jié)直腸癌SW480細胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），建立SW480細胞發(fā)生EMT的實驗研究模型，研究PRDX2對人結(jié)直腸癌SW480細胞EMT和轉(zhuǎn)移過程的影響并分析其可能分子作用機制。
　　方法

2、：
　　1.將PRDX2基因沉默、過表達及其相對應的空載對照慢病毒載體分別轉(zhuǎn)染SW480細胞，并建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株；采用免疫印跡(Western blot)和實時熒光定量PCR（qRT-PCR）法分別檢測PRDX2基因沉默、過表達細胞中PRDX2蛋白和mRNA表達；用MTT、克隆形成試驗檢測各轉(zhuǎn)染細胞增殖活性，Annexin V-PI染色檢測細胞凋亡率，劃痕實驗和Transwell侵襲實驗分別檢測細胞遷移、侵襲能力的變化，觀察PR

3、DX2在結(jié)直腸癌細胞生長及侵襲轉(zhuǎn)移中的作用。
　　2.利用TGF-β1誘導人結(jié)直腸癌SW480細胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)學變化，劃痕實驗檢測細胞體外遷移能力；細胞免疫熒光、Western blot和qRT-PCR方法檢測EMT標志蛋白E-cadherin、Vimentin的蛋白和mRNA表達。
　　3.一定濃度的TGF-β1分別誘導 PRDX2基因沉默（TGF-β1，5 ng/ml）和過表達（TGF-β

4、1，10 ng/ml）穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株，在倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)學變化；劃痕實驗和Transwell小室分別檢測各細胞體外遷移和侵襲能力；細胞免疫熒光、Western blot和qRT-PCR法檢測E-cadherin、Vimentin、Snail和Twist1蛋白和mRNA表達，觀察PRDX2在調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌細胞EMT進程中各相關因子表達。
　　4. PRDX2基因沉默組和過表達組細胞分別采用細胞免疫熒光檢測 NF-κB胞內(nèi)定

5、位情況；Western blot檢測NF-κB、IκBα、phospho-IκBαSer32、MMP-9、MMP-2蛋白表達；qRT-PCR檢測MMP-9、MMP-2 mRNA表達，觀察PRDX2在調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移過程中 NF-κB通路相關因子的表達變化；NF-κB通路特異性抑制劑 PDTC作用于PRDX2基因沉默細胞株，Western blot檢測NF-κB、IκBα、phospho-IκBαSer32、E-cadherin、

6、Snail、Twist1、MMP-9和MMP-2蛋白表達；qRT-PCR檢測E-cadherin、Snail、Twist1、MMP-9和MMP-2 mRNA表達，探討NF-κB通路阻斷后對PRDX2所調(diào)節(jié)的結(jié)直腸癌細胞EMT和轉(zhuǎn)移過程的影響。
　　結(jié)果：
　　1.與對照組相比，PRDX2沉默組細胞PRDX2蛋白和mRNA的表達顯著降低（P<0.05）；PRDX2過表達組細胞PRDX2蛋白和mRNA的表達顯著增加（P<0.05

7、），成功建立PRDX2基因沉默和過表達穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株；PRDX2基因沉默可明顯降低SW480細胞的增殖活性和克隆形成能力，促進細胞凋亡，同時細胞遷移、侵襲能力顯著增加（P<0.05）；PRDX2基因過表達后細胞增殖活性和克隆形成能力明顯增加，且細胞凋亡受到抑制，同時細胞遷移、侵襲能力較空載對照組明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　2.在TGF-β1誘導SW480細胞發(fā)生EMT過程中，細胞形態(tài)由上皮細胞形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)殚g質(zhì)

8、細胞形態(tài)，且細胞的遷移能力明顯增加(P<0.05)；EMT標記蛋白E-cadherin蛋白及mRNA表達水平顯著下降，同時Vimentin蛋白及mRNA表達明顯增加（P<0.05）。3.在5 ng/ml TGF-β1誘導下，PRDX2基因沉默組細胞呈紡錘體樣間質(zhì)細胞表型，且細胞遷移和侵襲能力明顯增強；E-cadherin蛋白及mRNA表達水平顯著下降，Vimentin、Snail和Twist1蛋白及mRNA表達水平均明顯增加（P<0.0

9、5）。在10 ng/ml TGF-β1誘導下，PRDX2基因過表達細胞仍大多呈上皮細胞形態(tài)，且細胞的遷移和侵襲能力受到抑制；E-cadherin蛋白及mRNA表達明顯增加，Vimentin、Snail和Twist1蛋白及mRNA表達水平均顯著降低（P<0.05）。
　　4. PRDX2基因沉默后NF-κB及phospho-IκBαSer32蛋白表達水平明顯增加，且免疫熒光顯示NF-κB大部分轉(zhuǎn)移至細胞核內(nèi)，但IκBα表達無明顯變化

10、，同時轉(zhuǎn)移相關因子MMP-9、MMP-2蛋白及mRNA表達量顯著增加（P<0.05）；而PRDX2基因過表達后NF-κB及phospho-IκBαSer32蛋白表達明顯降低，且NF-κB主要表達于細胞質(zhì)內(nèi)，轉(zhuǎn)移相關因子MMP-9、MMP-2蛋白及mRNA表達水平也顯著降低（P<0.05）。NF-κB通路特異性抑制劑PDTC作用PRDX2基因沉默細胞株后，上皮標記蛋白E-cadherin表達明顯上升，NF-κB、phospho-IκBαS

11、er32、Snail、Twist1、MMP-9和MMP-2表達明顯降低（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1. PRDX2基因沉默抑制結(jié)直腸癌SW480細胞增殖，促進細胞凋亡，且可以明顯增強細胞的遷移、侵襲能力；PRDX2基因過表達能夠增加SW480細胞的增殖能力，抑制細胞凋亡，并可以顯著抑制SW480細胞的遷移、侵襲能力。
　　2. PRDX2基因沉默促進結(jié)直腸癌SW480細胞發(fā)生EMT，從而促進細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移；P