鐵還原微生物的分離鑒定及系統(tǒng)發(fā)育學分析.pdf

1、細菌的異化Fe(Ⅲ)還原是生物進化過程中最早出現(xiàn)的生物能量代謝途徑，多種古細菌和真細菌具有還原Fe(Ⅲ)的能力。厭氧條件下環(huán)境中的Fe(Ⅲ)氧化物發(fā)生還原，并且這一過程主要是微生物介導的異化還原，即微生物以Fe(Ⅲ)氧化物為最終電子受體的厭氧呼吸過程。在自然界中只要存在厭氧環(huán)境，幾乎都會發(fā)生異化Fe(Ⅲ)還原現(xiàn)象，并發(fā)現(xiàn)有異化鐵還原微生物存在。異化Fe(Ⅲ)還原被認為是地球上最早的呼吸形式之一，在生命的進化歷程中這一遺傳烙印在一定范圍和

2、一定程度上都會被繼承，且勢必有更多的微生物種類都具有還原Fe(Ⅲ)的能力或潛能。因此，加強異化Fe(Ⅲ)還原研究對于揭示地球早期生命的能量代謝特征和生命進化具有重要的理論意義。水稻土作為一種研究氧化還原過程的模式系統(tǒng)一直受到人們的重視，其中鐵的氧化還原占有重要地位。因而系統(tǒng)開展Fe(Ⅲ)還原微生物特性的研究，對于闡明土壤中氧化鐵的微生物還原機理、認識異化鐵還原在稻田生態(tài)系統(tǒng)中的重要作用，促進水稻土中污染物的轉(zhuǎn)化與修復具有重要的理論和實際

3、意義。 本文通過對采自四川和江西兩地的典型水稻土樣品的厭氧富集培養(yǎng)試驗，初步確立了從水稻土中分離純化鐵還原微生物的方法。進一步對分離純化得到的一些菌株進行菌體菌落形態(tài)特征和生理特征鑒定和鐵還原菌利用不同碳源時的Fe(Ⅲ)還原特征比較，通過對鐵還原菌株的16S rDNA序列分析，以便確定其在系統(tǒng)發(fā)育分類中的地位。試驗得出以下主要結(jié)論： (1)采用富集培養(yǎng)方法，從四川水稻土中分離得到四株鐵還原菌P4、8<,13>、8<,18

4、>和8<,19>，從江西水稻土中分離得到三株鐵還原菌4<,03>、4<,10>和4<,20>。這7個菌株在菌體菌落形態(tài)和生理特征上表現(xiàn)出一定的共性。其菌落特征為：菌落較小，白色，隆起，規(guī)則圓，不透明，表面光滑，直徑3mm左右。染色結(jié)果表明，這7株菌為革蘭氏陽性，桿狀，圓末端。通過生長曲線測定，這7株菌在培養(yǎng)的10～25 h之間達到對數(shù)生長期。由此可知，在30℃培養(yǎng)條件下用50％LB液體培養(yǎng)基擴繁1d即可達到菌株的快速生長的要求。

5、 (2)通過將三代鐵還原菌接種于氫氧化鐵液體培養(yǎng)基中，以三代菌體的Fe(Ⅲ)的還原率對這7個菌株的鐵還原穩(wěn)定性進行考察，7個菌株的Fe(Ⅲ)的還原率均在70％～90％之間，說明這7株菌體的鐵還原能力比較穩(wěn)定。 (3)為了能更加準確地反映不同菌株在利用不同碳源時對Fe(OH)<,3>還原的影響，通過比較菌株P(guān)4在利用9.6 mmol/L和60 mmol/L 2種濃度碳源時對Fe(OH)<,3>還原的影響及其鐵還原特征分析得出，選用

6、60 mmol/L碳源濃度能較好的對不同鐵還原微生物進行鐵還原功能強弱的初步劃分。 (4)不同碳源利用試驗表明，葡萄糖和丙酮酸鈉可作為這7個菌株的優(yōu)勢碳源。這7個菌株在利用葡萄糖時的Fe(Ⅲ)還原量最大，反應速率(V)最高。不同菌株利用葡萄糖的Fe(Ⅲ)還原最大潛勢大小順序為：菌株8<,18>>4<,20>>4<,03>>8<,13>>P4>4<,10>>8<,19>。由計算出的鐵還原率比較可知，菌株8<,18>的Fe

7、(Ⅲ)還原率最高，高達92.11％，最低的菌株8<,19>只有24.52％。整個體系在添加葡萄糖、丙酮酸鈉培養(yǎng)初期的pH迅速下降至最低點4.5～5.5之間，隨后緩慢回升至6.5左右。而添加其他碳源時鐵還原進行的緩慢，pH始終維持在7.0～7.5左右?？梢娫谖⑸镎ＩL的pH范圍內(nèi)，較低的pH利于Fe(Ⅲ)的還原。 (5)采用PCR技術(shù)獲得了1325 bp的鐵還原菌株P(guān)4的部分16S rDNA序列。經(jīng)NCBI的MegaBlast

8、同源性分析和利用Clustal和Phylip軟件構(gòu)建鐵還原菌株P(guān)4與相關(guān)菌株16S rDNA的系統(tǒng)進化樹，可以看出鐵還原菌株P(guān)4與多種不可培養(yǎng)的厭氧菌株(DQ441334，DQ083720，DQ083732，AM176850，AY953222)均達到98％同源性，并且和多種丁酸梭狀芽孢桿菌株(AY604563，AM176850，DQ831126，X77834，AF005092)也有98％的同源性。因此可將菌株P(guān)4歸屬為厭氧丁酸梭狀芽胞桿