第十二章微生物的進化、系統(tǒng)發(fā)育和分類鑒定

1、微生物的進化、系統(tǒng)發(fā)育和分類鑒定,第一節(jié) 緒論第二節(jié) 進化的測量指征第三節(jié) 細 菌 分 類 第三節(jié) 微生物分類鑒定的特征和技術,第一節(jié) 緒論,地球大約是在45億年前形成的。地質(zhì)學、古生物學和地球化學直接或間接證據(jù)都表明：大約在地球形成10億年之后，我們這個星球開始出現(xiàn)生命，主要是些類似簡單桿狀細菌的原始生物。但在同期的、另外一些被認為是由光合微生物與沉積物形成的片層狀化石——疊層石（stromatolites）

2、，它們類似于綠硫細菌和多細胞絲狀細菌，這些原始生命大概都是厭氧型的。含有產(chǎn)氧型光合細菌——藍細菌的層疊石則發(fā)現(xiàn)于25-30億年前的地質(zhì)年代中，藍細菌的出現(xiàn)，給地球帶來了氧氣。而后，各種真核生物才隨之出現(xiàn)。,第一節(jié) 緒論,根據(jù)現(xiàn)代生物進化論觀點 ：所謂進化（evolution）是生物與其生存環(huán)境相互作用過程中，其遺傳系統(tǒng)隨時間發(fā)生一系列不可逆的改變，在大多數(shù)情況下，導致生物表型改變和對生存環(huán)境的相對適應。系統(tǒng)發(fā)育（phyloge

3、ny）就指的是研究各類微生物進化的歷史。,第一節(jié) 緒論,科學家估計有分類紀錄的各類物種大約有150萬，其中微生物超過10萬種，而且其數(shù)目還在不斷增加。微生物學工作者要認識、研究和利用微生物或控制有害微生物，必須對它們進行分類（classification）。,第一節(jié) 緒論,對生物進行分類存在兩種基本的、截然不同的分類原則： 一是根據(jù)表型(phenetic)特征的相似成都分群歸類，這種表型分類重在應用，不涉及生物進化或不以反映生

4、物親緣關系為目標；第二種分類原則是要按照生物系統(tǒng)發(fā)育相關性水平來分群歸類，其目標是探尋各種生物之間的進化關系，建立反映生物系統(tǒng)發(fā)育的分類系統(tǒng)。,第一節(jié) 緒論,因此，以進化論為指導思想的分類學(taxonomy)，其目的已經(jīng)不僅僅是物種的識別和歸類，其主要目標是通過追溯系統(tǒng)發(fā)育，推斷進化譜系，這樣的分類學也稱之為生物系統(tǒng)學(syatematics)。,第一節(jié) 緒論,分子生物學的發(fā)展，使我們不僅可以根據(jù)表型特征，而且可以從分子水平

5、上，通過研究和比較微生物乃至整個生物界的基因型特征來探討生物的進化、系統(tǒng)發(fā)育和進行分類鑒定。,第二節(jié) 進化的測量指征,20世紀70年代以前，生物類群間的親緣關系主要是根據(jù)形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理生化、行為習性等表型特征以及少量的化石資料來判斷它們之間的親緣關系。直到60—70年代，有識之士才清醒地認識到：僅依靠表型特征無法解決微生物的系統(tǒng)發(fā)育問題，必須尋找新的特征作為生物進化的指征。,一、進化指征的選擇,根據(jù)形態(tài)學特征推斷生物之間的親緣關系

6、存在兩個突出問題：一是由于微生物可利用的形態(tài)特征少，很難把所有生物放在同一水平上進行比較； 二是形態(tài)特征在不同類群眾中進化速度差異很大，僅根據(jù)形態(tài)推斷進化關系往往不準確。,一、進化指征的選擇,20世紀70年代以后研究為生物的系統(tǒng)發(fā)育，主要是分析和比較生物大分子的結(jié)構(gòu)特征，特別是蛋白質(zhì)、RNA和DNA這些反映生物基因組特征的分子序列，作為判斷各類微生物乃至所有生物進化關系的主要特征。,一、進化指征的選擇,為了準確確定各種生物之間的進

7、化關系，還必須挑選恰當?shù)拇蠓肿觼磉M行序列研究。在挑選大分子時應注意以下幾點： ①它必須普遍存在于所研究的各個生物類群中。如果我們所研究的是整個生命界的進化，那么所選擇的分子必須在所有生物中存在，這樣才便于分析和比較。,一、進化指征的選擇,②選擇在各種生物中功能同源的大分子。催化不同反應的酶的氨基酸序列或者具有不同功能核酸的核苷酸序列不能進行比較，因為功能不相關的分子也意味著進化過程中來源不同，對這一類不相關分子進行比較也不期望他們會

8、表現(xiàn)出序列的相似性。所以，大分子進化的研究必須從鑒定大分子的功能開始。,一、進化指征的選擇,③為了鑒定大分子序列的同源位置或同源區(qū)，要求所選擇的分子序列必須能嚴格線性排列，以便進行進一步的分析比較。 ④還應注意根據(jù)所比較的各類生物之間的進化距離來選擇適當?shù)姆肿有蛄小?二、rRNA作為進化的指征,大量的實驗研究表明：在眾多的生物大分子中，最適合于揭示各類生物親緣關系的是rRNA,尤其是16SrRNA。16SrRNA所以被普遍公認是一把

9、好的譜系分析的“分子尺”，這是因為：,二、rRNA作為進化的指征,①rRNA參與生物蛋白質(zhì)的合成過程，其功能是任何生物都必不可少的，而且在生物進化的漫長歷程中，其功能保持不變； ②在16SrRNA分子中，即含有高度保守的序列區(qū)域，又有中度保守和高度變化的序列區(qū)域，因而它適用于進化距離不同的各類生物親緣關系的研究；,二、rRNA作為進化的指征,③16SrRNA相對分子質(zhì)量大小適中，便于序列分析； ④16SrRNA普遍存

10、在于真核生物和原核生物中（真核生物中其同源分子是18SrRNA）。,三、rRNA的順序和進化,rRNA序列測定和分析方法分兩類：寡核苷酸編目法和全序列分析法。 1.     寡核苷酸編目分析法 20世紀80年代以前的研究,主要是采用寡核苷酸編目分析法。,三、rRNA的順序和進化,2.     全序列分析法寡核苷酸編目分析法，只獲

11、得了16SrRNA分子的大約30%的序列資料，加上采用的是一種簡單相似性的計算方法，所以其結(jié)果有可能出現(xiàn)誤差，應用上受到一定限制。隨著核算序列分析技術的發(fā)展，20世紀80年代末又陸續(xù)發(fā)展了一些rRNA全序列分析方法，其中最常用的是直接序列分析法。這種方法用反轉(zhuǎn)錄酶和雙脫氧序列分析，可以對未經(jīng)純化的rRNA抽提物進行直接的序列測定。,四、系統(tǒng)發(fā)育樹,在研究生物進化和系統(tǒng)分類中，常用一種樹狀分枝的圖型來概括各種（類）生物之間的親緣關系，

12、這種樹狀分枝的圖型被稱為系統(tǒng)發(fā)育樹（phylogenetic tree），簡稱系統(tǒng)樹。通過比較生物大分子序列差異的數(shù)值構(gòu)件的系統(tǒng)樹稱為分子系統(tǒng)樹。圖型中，分枝的末端和分枝的連接點稱為結(jié)（node），代表生物類群，分枝末端的結(jié)代表仍生存的種類。系統(tǒng)樹可能有時間比例，或者用兩個結(jié)之間的分枝長度變化來表示分子序列的差異數(shù)值。,五、三界生物的主要特征,根據(jù)形態(tài)和生理特征把地球上的生物分為動物界和植物界的理論，統(tǒng)治了生物學100多年，20世

13、紀60年代主要根據(jù)細胞核的結(jié)構(gòu)把生物分為原核生物和真核生物兩大類。,五、三界生物的主要特征,1.生命中的第三種形式 將生物分成三界（Kingdom）（后來改稱三個域）：古細菌、真細菌（Eubacteria）真核生物（Eukaryotes）。1990年，他為了避免把古細菌也看作是細菌的一類，又把三界（域）改稱為Bacteria（細菌）、Archaea(古生菌)和Eukarya（真核生物），并構(gòu)建了三界（域）生物的

14、系統(tǒng)樹（圖12-3）。,五、三界生物的主要特征,2.三（界）域生物的主要特征 三界理論雖然是根據(jù)16Sr RNA序列的比較提出的，但其他特征的比較研究結(jié)果也在一定程度上支持了三界生物的劃分。,第三節(jié) 細 菌 分 類,分類是認識客觀事物的一種基本方法。我們要認識、研究和利用各種微生物資源也必須對他們進行分類。分類學內(nèi)容涉及三個相互依存又有區(qū)別的組成部分：分類、命名和鑒定。,第三節(jié) 細 菌 分 類,分類（clas

15、sification）是根據(jù)一定的原則（表型特征相似性或系統(tǒng)發(fā)育相關性）對微生物進行分群歸類，根據(jù)相似性或相關性水平排列成系統(tǒng)，并對各個分類群的特征進行描述，以便考察和對未被分類的微生物進行鑒定；命名（nomenclature）是根據(jù)命名法規(guī)，給每一個分類群一個專有的名稱；,第三節(jié) 細 菌 分 類,鑒定（identification或determination）則是指借助于現(xiàn)有的微生物分類系統(tǒng)，通過特征測定，確定未知的、新發(fā)現(xiàn)的或

16、未明確分類地位的微生物所應歸屬分類群的過程。,第三節(jié) 細 菌 分 類,一.分類單元及其等級 界Kingdom 門Phylum——亞門 綱Class——亞綱 目Order——亞目 科Family——亞科 屬Genus

17、 種Species,一.分類單元及其等級,常用的細菌分類術語培養(yǎng)物（culture),是指一定時間一定空間內(nèi)微生物的細胞群或生長物。菌株（strain)，從自然界分離得到的任何一種微生物的純培養(yǎng)物都可以稱為微生物的一個菌株；用實驗方法（如通過誘變）所獲得的某一菌株的變異型，也可以稱為一個新的菌株，以便與原來的菌株相區(qū)別。,一.分類單元及其等級,型（form或type),常指亞種以下的細分，當同種或同亞種不同菌株之

18、間的性狀差異，不足以分為心的亞種時，可以細分為不同的型。種（species),是生物分類中基本的分類單元和分類等級。,第三節(jié) 細 菌 分 類,二. 微生物的命名1.分類單元的命名 ⑴ 屬名 屬名用一個單數(shù)主格名詞或當作名詞用的形容詞來表示，可以是陽性、陰性或中性，首字母要大寫。⑵ 種名 和其他生物一樣，細菌的種名也用雙名法（binomial nomenclature）命名，即種的學名由屬名和種名加詞兩部分組合而成。 ⑶ 亞

19、種名 亞種名為三元式組合，即由屬名、種名加詞和亞種名加詞構(gòu)成。,二. 微生物的命名,2. 命名模式及其指定 如前所述，由于細菌分類單元的劃分缺乏一個易于操作的統(tǒng)一標準，為了減少因采用不同標準界定分類單元所造成的混亂， 細菌系統(tǒng)分類也像其他生物分類一樣采用“模式概念”。即根據(jù)命名法規(guī)要求，正式命名的分類單元應指定一個命名模式（簡稱模式）作為該分類單元命名的依據(jù)。,二. 微生物的命名,3. 新名稱的發(fā)表 根據(jù)細菌命名法規(guī)的規(guī)定，有效發(fā)表新的

20、細菌名稱應在公開發(fā)行的刊物上進行，在菌種目錄、會議記錄、會議論文摘要的均不能視為有效發(fā)表。此外，若新名稱是在國際系統(tǒng)細菌學雜志（IJSB）以外的其他雜志上發(fā)表的，還必須經(jīng)過新名稱的合格化發(fā)表，被認為合格后，在該雜志上定期公布，命名日期即從公布之日算起，否則不算合格發(fā)表，也不能取得國際上的承認。發(fā)表新名稱時，應在新名稱之后加上所屬新分類等級的縮寫詞，如新目“ord.nov.”、新屬“gen.nov.”、新種“sp.nov.”等。,第三節(jié)

21、 細 菌 分 類,三、細菌分類和伯杰氏手冊 20世紀60年代以前，國際上不少細菌分類學家都曾對細菌進行過全面的分類，提出過一些在當代有影響的細菌分類系統(tǒng)。但70年代以后，對細菌進行全面分類的、影響最大的是《伯杰氏手冊》。所以該書目前已成為對細菌進行分類鑒定的主要參考書。,第四節(jié) 微生物分類鑒定的特征和技術,鑒于微生物體形微小、結(jié)構(gòu)較簡單等特點，微生物分類和鑒定除了像高等生物那樣，采用傳統(tǒng)的形態(tài)學、生理學和生態(tài)學

22、特征之外，還必須尋找新的特征作為分類鑒定的依據(jù)。在這方面微生物分類學家比動植物分類學家表現(xiàn)了更高的熱情，他們從不同層次（細胞的、分子的）、用不同學科（化學、物理學、遺傳學、免疫學、分子生物學等）的技術方法來研究和比較不同微生物的細胞、細胞組分或代謝產(chǎn)物，從中發(fā)現(xiàn)反映微生物類群特征的資料作為微生物分類鑒定的依據(jù)。,第四節(jié) 微生物分類鑒定的特征和技術,一、形態(tài)學和生理生化特征1．形態(tài)學特征 形態(tài)學特征始終被用作微生物分類和鑒定的重

23、要依據(jù)之一，其中有兩個重要原因：一是它易于觀察和比較，尤其是在真核微生物和具有特殊形態(tài)結(jié)構(gòu)的細菌中； 二是許多形態(tài)學特征依賴于多基因的表達，具有相對的穩(wěn)定性。因此，形態(tài)學特征不僅是微生物鑒定的重要依據(jù)，而且也往往是系統(tǒng)發(fā)育相關性的一個標志。常用于原核生物分類鑒定的形態(tài)學特征,一、形態(tài)學和生理生化特征,2．生理生化特征 生理生化特征和微生物的酶和調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的本質(zhì)和活性直接相關，酶及蛋白質(zhì)都是基因的產(chǎn)物。所以，對微生物生理生化特征和

24、比較也是對微生物基因組的間接比較，加上測定生理生化特征比直接分析基因組要容易得多。因此生理生化特征對于微生物的系統(tǒng)分類仍然是有意義的。,第四節(jié) 微生物分類鑒定的特征和技術,二、血清學試驗與噬菌體分型1．血清學試驗細菌細胞與病毒等都含有蛋白質(zhì)、脂白蛋、脂多糖等有抗原性的物質(zhì)，由于不同微生物抗原物質(zhì)結(jié)構(gòu)不同，賦予它們不同的抗原特征。一種細菌的抗原除了可與它自身的抗體起特異性免疫反應外，若它與其它種類的細菌有共同的抗原組分，它們的抗

25、原抗體之間就會發(fā)生交叉反應。,二、血清學試驗與噬菌體分型,2.噬菌體分型在原核生物中已普遍發(fā)現(xiàn)有響應種類的噬菌體.噬菌體對宿主的感染和列解作用具有高度的特異性,即一種噬菌體往往只能感染或裂解某種細菌,甚至只裂解種內(nèi)的某些菌株.所以,根據(jù)噬菌體的宿主范圍可將細菌分為不同的噬菌型和利用噬菌體裂解這樣的特異性進行細菌鑒定.這對于追溯傳染病來源、流行病調(diào)查以及病原菌的檢測鑒定有重要意義.,第四節(jié) 微生物分類鑒定的特征和技術,三、氨基酸的

26、順序和蛋白質(zhì)的分析 蛋白質(zhì)是基因的產(chǎn)物,.蛋白質(zhì)的氨基酸順序直接反映mRNA順序而與編碼基因密切相關.因此,可以通過對某些同源蛋白質(zhì)氨基酸順序的比較來分析不同生物系統(tǒng)發(fā)育關系,序列相似性越高,其親緣關系愈近.因此可以根據(jù)蛋白質(zhì)的氨基酸序列資料構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹和進行分類.,第四節(jié) 微生物分類鑒定的特征和技術,四、核酸的堿基組成和分子雜交 比較DNA和堿基組成和進行核酸分子雜交,是目前通過直接比較基因組進行生物分類最

27、常用的兩種方法.1.DNA的堿基組成[(G+C)%],四、核酸的堿基組成和分子雜交,DNA分子含有四種堿基：腺嘌呤、鳥胞嘧啶胸腺.DNA的堿基組成和排列順序決定生物的遺傳性狀,所以DNA堿基組成是各種生物的一個穩(wěn)定特征.它不受年齡和突變因素以外的外界條件的影響,即使個別基因突變, 堿基組成也不會發(fā)生明顯變化.分類學上,用G+C占全部堿基的物質(zhì)的量百分數(shù)(G+C)%來表示各種生物的DNA堿基組成特征.,四、核酸的堿基組成和分子雜交,

28、每一種生物都有一定的堿基組成親緣關系近的生物,它們應該具有相似的G+C含量,若不同的生物之間G+C含量差別大表明它們關系遠.現(xiàn)有數(shù)據(jù)表明:高等植物的G+C含量范圍大約35%～50%之間;原核生物中G+C含量變化幅度寬達22%～80%;脊椎動物G+C含量約35%～45%之間;原核生物中G+C含量變化幅可達22%～80%這也足以表明原核生物是一個極其多樣性的類群.,四、核酸的堿基組成和分子雜交,目前,雖然還沒有一個統(tǒng)一的界定各級分

29、類單元的G+C含量標準,但大量資料表明:同一個種內(nèi)的不同菌株G+C含量差別應在4%～5%以下;同種不同屬的差別在10%～15%,通常底于10%.所以G+C含量已經(jīng)作為建立新的微生物分類單元的一項基特征,它對于種、屬甚至科的鑒定有重要意義.,四、核酸的堿基組成和分子雜交,例如,80年代以前螺菌屬(Spirillum)不同的G+C含量高達38%～66%,后來伯杰氏手冊(1984)結(jié)合其他特征已將其分為三個屬:螺藻屬、海洋螺菌屬(Oce

30、anospirillum)和水螺菌屬(Aquaspirillum),它們的G+C含量分別為38%、42% ～ 51%和49%～66%;過去根據(jù)形學特征曾認為球菌屬(Micrococcus)葡萄球菌屬(Staphylococcus)是關系很近的兩個屬,因而長期放在一個科里,由于G+C含量的差異表明它們的親緣關系相當遠,現(xiàn)在根據(jù)16SrDNA序列資料已進行新的調(diào)整.,四、核酸的堿基組成和分子雜交,然而,值得強調(diào)的是: G+C含量的分類學意

31、義主要是作為建立新分類單元的一項基本特征和把那些G+C含量差別大的種類排除出某一分類單元. 測定DNA堿基組成的方法很多,常用的是熱變性溫度法、浮力密度法和高效液相色普法.,四、核酸的堿基組成和分子雜交,2．核酸的分子雜交 生物的遺傳信息以（遺傳密碼）形式線性的排列在DNA分子中，不同DNA堿基排列順序的異同直接反映這些生物之間親緣關系的遠近，堿基排列順序差異越小，它們之間的親緣關系越近，反之亦然。,四、核酸的

32、堿基組成和分子雜交,核酸分子雜交在微生物分類鑒定中的應用包括：DNA—DNA雜交、DNA—rDNA雜交以及根據(jù)核酸雜交特異性原理制備核酸探針。(1) DNA—DNA雜交 親緣關系相對近的微生物之間的親緣比較,四、核酸的堿基組成和分子雜交,(2) DNA—DNA雜交 親緣關系相對遠的微生物之間的親緣比較 (3)核酸探針 利用特異性的探針，用于細菌等的快速鑒定,四、核酸的堿基組成和分子雜交,3．電子雜交