食品微生物第十二章常見致病g資料

1、第十二章 常見革蘭氏陽性致病菌,基本內(nèi)容: 葡萄球菌（金黃色葡萄球菌）、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌和蠟樣芽孢桿菌的基本生物學(xué)特性，來源、分布及傳播途徑，導(dǎo)致的常見疾?。òY狀和致病機(jī)理），常用檢測(cè)方法，預(yù)防和控制方法。,重點(diǎn)和難點(diǎn): 金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌和蠟樣芽孢桿菌的生物學(xué)特性，常見病癥狀和致病機(jī)理，檢測(cè)方法。,第一節(jié) 葡萄球菌和金黃色葡萄球菌病,一、概述,1880年，巴斯德首次從一患者瘀腫

2、的膿汁中發(fā)現(xiàn)葡萄狀排列的細(xì)菌，將其注射給家兔后可致膿瘡；,1883年，Becker獲得了純培養(yǎng)，證實(shí)該菌為葡萄球菌屬；,,,,1881年，Ogsten確證化膿過程是“某”菌所致；,一、概述,葡萄球菌（Staphylococcus)因堆聚成葡萄串狀而得名，為最常見的化膿性球菌；,葡萄球菌屬在分類地位上屬于微球菌科的一個(gè)屬（目前有32種，寄生人體的有16種），大部分為非致病菌，少數(shù)可導(dǎo)致疾病。葡萄球菌是醫(yī)院交叉感染的重要來源。,,,金黃色葡

3、萄球菌（S.aureus),表皮葡萄球菌（S.epedermidis),腐生葡萄球菌（S.saprophyticus),金黃色葡萄球菌為最常見致病菌,一、概述,美國CDC報(bào)道：美國由金黃色葡萄球菌腸毒素引起的食物中毒占整個(gè)細(xì)菌性食物中毒的33%，加拿大為45%；我國和其它國家也有類似的情況。,金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)在自然界中無處不在，空氣、土壤、水、飼料、食品、灰塵及人和動(dòng)物的排泄物中均可找到；,一

4、、概述,,,二、葡萄球菌的基本特性,2.1 形態(tài)結(jié)構(gòu) 葡萄球菌呈球形或稍呈橢圓形，直徑0.4～1.2μm，分裂后許多菌體無規(guī)則的堆積在一起，成葡萄串狀。,葡萄球菌無鞭毛，不能運(yùn)動(dòng)。無芽胞，除少數(shù)菌株外一般不形成莢膜。易被常用的堿性染料著色，革蘭氏染色為陽性。,二、葡萄球菌的基本特性 (2.1 形態(tài)結(jié)構(gòu)）,其衰老、死亡或被白細(xì)胞吞噬后，以及耐藥的某些菌株可被染成革蘭氏陰性。,二、葡萄球菌的基本特性,2.2 培養(yǎng)特征,營養(yǎng)要求

5、不高，普通瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，形成圓形凸起，邊緣整齊，表面光滑，濕潤(rùn)，不透明的菌落。,在含有血液和葡萄糖的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)更佳。 在肉湯培養(yǎng)基中24h后呈均勻混濁生長(zhǎng)。 需氧或兼性厭氧，少數(shù)專性厭氧。,不同種的菌株產(chǎn)生不同的色素，色素為脂溶性，如金黃色、白色、檸檬色。 血瓊脂平板上形成的菌落較大，有的菌株菌落周圍形成明顯的全透明溶血環(huán)（β溶血），也有不發(fā)生溶血者。 凡溶血性菌株大多具有致病性。,二、葡萄球菌

6、的基本特性（2.2 培養(yǎng)特征）,金黃色葡萄球菌（β溶血）,表皮葡萄球菌,28-38℃均能生長(zhǎng)，致病菌最適溫度為37℃，pH為4.5-9.8，最適為7.4；,二、葡萄球菌的基本特性（2.2 培養(yǎng)特征）,在含有20～30% CO2的環(huán)境中培養(yǎng)，可產(chǎn)生大量毒素。,耐鹽性強(qiáng)，在含有10～15%的NaCl培養(yǎng)基中能生長(zhǎng)；,二、葡萄球菌的基本特性,2.3 生理生化特性,各種葡萄球菌的主要生理生化特性,各種葡萄球菌的主要生理生化性狀（續(xù)表）,二、葡萄

7、球菌的基本特性（2.3 生理生化特性）,二、葡萄球菌的基本特性（2.3 生理生化特性）,注：“＋”為陽性，“－”為陰性。,各種葡萄球菌的主要生理生化性狀（續(xù)表）,二、葡萄球菌的基本特性,2.4 抗原結(jié)構(gòu),葡萄球菌抗原結(jié)構(gòu)復(fù)雜，已發(fā)現(xiàn)的有30種以上，對(duì)其活性及組成比較了解的有以下幾種：,2.4.1 葡萄球菌A蛋白 （Staphylococcal protein A， SPA) SPA是存在于90%以上的金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁表

8、面的一種蛋白質(zhì)， 是一種單鏈多肽，與細(xì)胞壁肽聚糖共價(jià)連接，但有1/3分泌于胞外。,SPA為完全抗原，具有特異性，它可與人IgG1、 IgG2和IgG4的Fc段發(fā)生非特異性結(jié)合。 具有與吞噬細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)Fc段復(fù)合物、促細(xì)胞分裂、引起超敏反應(yīng)、損傷血小板等多種生物活性。,二、葡萄球菌的基本特性（2.4 抗原結(jié)構(gòu)）,所有來自人類的菌株均有此抗原，動(dòng)物源株則少見。,二、葡萄球菌的基本特性（2.4 抗原結(jié)構(gòu)）,2.4.2 多糖抗原 多糖抗原為

9、半抗原，有兩種，具群特異性，可用以分群。 A群多糖抗原多存在于金黃色葡萄球菌，其化學(xué)組成為N-乙酰葡萄糖胺核糖醇磷壁酸（多糖A）。 B群多糖抗原多存在于表皮葡萄球菌，化學(xué)組成是N-乙酰葡萄糖甘油型磷壁酸（多糖B）。,二、葡萄球菌的基本特性（2.4 抗原結(jié)構(gòu)）,2.4.3 莢膜抗原 主要為金黃色葡萄球菌菌株的表面抗原。,幾乎所有金黃色葡萄球菌菌株表面都有莢膜抗原的存在，個(gè)別表皮葡萄球菌菌株有此抗原。,二、葡萄

10、球菌的基本特性,2.5 抵抗力,葡萄球菌抵抗力較強(qiáng)，為不形成芽孢的細(xì)菌中最強(qiáng)者。 在干燥的膿汁或血液中可存活數(shù)月；80℃加熱30 min才能將其殺死，煮沸可迅速使其死亡；在5%石炭酸或0.1%汞中10～15min死亡。 對(duì)某些染料較敏感，1∶100 000～1∶200 000稀釋的龍膽紫溶液能抑制其生長(zhǎng)；對(duì)磺胺類藥物的敏感較低，對(duì)青霉素、紅霉素和慶大霉素高度敏感。,葡萄球菌腸毒素是一種外毒素，具耐熱性，經(jīng)100℃加熱30

11、min而不被破壞，要使其完全破壞需煮沸2h（葡萄球菌腸毒素的特點(diǎn)）；,二、葡萄球菌的基本特性（2.5 抵抗力）,其他如溶血素、殺白血球素等經(jīng)100℃加熱10min或80℃加熱20min就可喪失毒性。,二、葡萄球菌的基本特性,2.6 金黃色葡萄球菌噬菌體型 依據(jù)：絕大多數(shù)金黃色葡萄球菌可被相應(yīng)的噬菌體裂解。,根據(jù)噬菌體對(duì)金黃色葡萄球菌菌株的裂解反應(yīng)，可將金黃色葡萄球菌分為5群26型（見下表）：,二、葡萄球菌的基本特性（2.6

12、金黃色葡萄球菌噬菌體分型）,金黃色葡萄球菌噬菌體分型,二、葡萄球菌的基本特性（2.6 金黃色葡萄球菌噬菌體分型）,腸毒素型食物中毒主要是由Ⅲ、Ⅳ群的金黃色葡萄球菌引起； 造成醫(yī)院感染嚴(yán)重流行的多為Ⅰ群中的52、52A、80型引起。,噬菌體分型在金黃色葡萄球菌流行病學(xué)調(diào)查、追蹤傳染源及研究菌型與疾病的關(guān)系等方面均有重要意義。,,三、致病性葡萄球菌的分布及污染途徑,3.1 分布 流行呈季節(jié)性分布，多見于夏、秋兩季。

13、 引起中毒食品種類：奶、肉、蛋、魚及其制品等動(dòng)物性產(chǎn)品；此外，剩飯、油煎蛋、糯米糕、涼粉等也經(jīng)常被其污染而導(dǎo)致中毒。,三、致病性葡萄球菌的分布及污染途徑,3.2 污染途徑,不同人群或動(dòng)物金黃色葡萄球菌帶菌率,三、致病性葡萄球菌的分布及污染途徑,途徑二：食品二次污染,熟肉類食品如在熟后污染了致病性葡萄球菌，又在20～30℃的環(huán)境下放置較長(zhǎng)時(shí)間，極易引起中毒； 奶和奶制品，用奶制作的冷飲（冰激凌、冰棍）和奶油糕點(diǎn)常是引起中毒的

14、食品；,三、致病性葡萄球菌的分布及污染途徑（3.2 污染途徑）,油煎雞蛋、熏魚、油浸魚罐頭等含油脂較多的食品，在污染上致病性葡萄球菌以后也能產(chǎn)生毒素。,,四、金黃色葡萄球菌的致病性,4.1 致病類型及癥狀,有侵襲性疾病和毒素性疾病兩種類型。4.1.1 侵襲性疾病癥狀：主要引起化膿性感染。 金黃色葡萄球菌可通過多種途徑侵入肌體，引起局部組織、內(nèi)臟器官或全身性化膿感染。,局部感染主要表現(xiàn)為：甲溝炎、麥粒腫、蜂窩織炎、傷口化膿等；

15、,四、金黃色葡萄球菌的致病性（4.1 致病類型及癥狀）,甲溝炎,麥粒腫,蜂窩織炎,內(nèi)臟器官感染如：肺炎、膿胸、中耳炎、腦膜炎、心包炎、心內(nèi)膜炎等； 全身感染如：敗血癥、膿毒血癥等。,四、金黃色葡萄球菌的致病性（4.1 致病類型及癥狀）,心包炎,心內(nèi)膜炎,4.1.2 毒素性疾病,,主要由金黃色葡萄球菌毒素所致。毒素性疾病有兩種：,A. 食物中毒： 人攝入含毒素污染的食物后1～6h即可出現(xiàn)頭暈、惡心、腹瀉、嘔吐等急性胃腸炎癥狀。

16、發(fā)病1～2d可自行恢復(fù)，愈后良好。,四、金黃色葡萄球菌的致病性（4.1 致病類型及癥狀）,四、金黃色葡萄球菌的致病性（4.1 致病類型及癥狀）,B. 毒性休克綜合癥 由毒性休克綜合癥毒素1（TSST-1）引起。 主要表現(xiàn)：高熱、低血壓、嘔吐、腹瀉、猩紅樣皮疹、嚴(yán)重者出現(xiàn)休克。 注意： TSST-1并非是引起該綜合癥的唯一病因，細(xì)菌內(nèi)毒素、葡萄球菌腸毒素也與毒性休克綜合癥發(fā)病有關(guān)。,四、金黃色葡萄球菌的致病性,4.

17、2 致病因子及相應(yīng)致病機(jī)理,金黃色葡萄球菌的致病性取決于其產(chǎn)生的毒素的致病能力。,4.2.1 血漿凝固酶（Coagulase) 是一種能使含有檸檬酸鈉或肝素抗凝劑的兔或人血漿發(fā)生凝固的酶。 大多數(shù)致病性葡萄球菌可產(chǎn)生此酶，非致病菌則不產(chǎn)生。,四、金黃色葡萄球菌的致病性（ 4.2 致病因子及相應(yīng)致病機(jī)理）,血漿凝固酶有2種：,A：游離凝固酶（free coagulase) 分泌至胞外，被血漿中凝固酶

18、反應(yīng)因子激活，形成葡萄球菌凝血酶（staphylothrombin)，能使纖維蛋白原變?yōu)槔w維蛋白，導(dǎo)致血漿凝固。 纖維蛋白沉積于菌體表面，阻礙體內(nèi)吞噬細(xì)胞的吞噬，即使被吞噬后，也不易被殺死。,四、金黃色葡萄球菌的致病性（ 4.2 致病因子及相應(yīng)致病機(jī)理）,凝固酶集聚在菌體四周，可能保護(hù)病菌不受血清中殺菌物質(zhì)的作用。,B：結(jié)合凝固酶（bound coagulase) 也叫凝聚因子（clumping factor

19、)，在菌體表面并不釋放，為纖維蛋白原特異性受體，能與人或兔血漿中纖維蛋白原交聯(lián)而引起細(xì)菌凝聚。,四、金黃色葡萄球菌的致病性（ 4.2 致病因子及相應(yīng)致病機(jī)理）,凝固酶試驗(yàn)是鑒定金黃色葡萄球菌的重要標(biāo)志。,凝固酶較耐熱，100℃加熱30min或高壓滅菌后仍保存部分活性，但易被蛋白分解酶破壞。,凝固酶具有免疫原性，刺激機(jī)體產(chǎn)生的抗體對(duì)凝固酶陽性的細(xì)菌感染有一定的保護(hù)作用。,四、金黃色葡萄球菌的致病性（ 4.2 致病因子及相應(yīng)致病機(jī)理）,凝固

20、酶具抗原性，可用于金黃色葡萄球菌的分型研究及流行病學(xué)研究。,四、金黃色葡萄球菌的致病性（ 4.2 致病因子及相應(yīng)致病機(jī)理）,4.2.2 溶細(xì)胞毒素 該毒素為膜損傷毒素，主要有葡萄球菌溶素（staphylolysin)和殺白細(xì)胞素（leukocidin)。,A：葡萄球菌溶素 外毒素，多數(shù)致病菌株能產(chǎn)生，可使動(dòng)物紅細(xì)胞溶解，使血瓊脂平板菌落周圍出現(xiàn)溶血環(huán)，在試管中出現(xiàn)溶血反應(yīng)。,四、金黃色葡萄球菌的致病性（ 4.2 致

21、病因子及相應(yīng)致病機(jī)理）,根據(jù)其對(duì)動(dòng)物細(xì)胞的溶血范圍、抗原性、溶血時(shí)所需溫度不同等可將金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的葡萄球菌溶素分為α、β、γ、δ、ε五種。 五種溶素都是蛋白質(zhì)，具抗原性。,四、金黃色葡萄球菌的致病性（ 4.2 致病因子及相應(yīng)致病機(jī)理）,對(duì)人體有致病作用的主要是α溶素和β溶素。,α溶素：由質(zhì)?；蛉旧w編碼，分子量為30kD，不耐熱， 60℃加熱3min即可被破壞。除對(duì)多種哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞有溶血作用外，對(duì)白細(xì)胞、血小板、肝細(xì)

22、胞、成纖維細(xì)胞膜、血管平滑肌等均有毒性作用，可引起組織壞死。 作用機(jī)理：毒素分子插入細(xì)胞膜疏水區(qū)，從而破壞膜完整性造成細(xì)胞溶解。,四、金黃色葡萄球菌的致病性（ 4.2 致病因子及相應(yīng)致病機(jī)理）,β溶素：為神經(jīng)鞘磷脂酶C （sphingomyelinase C)，能水解細(xì)胞膜磷脂，損傷紅細(xì)胞、白細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和纖維細(xì)胞，與組織壞死和膿腫形成有關(guān)。,四、金黃色葡萄球菌的致病性（ 4.2 致病因子及相應(yīng)致病機(jī)理）,B：殺白細(xì)胞素

23、 又稱為Panton-Valentine(PV)殺白細(xì)胞素，由大多數(shù)致病性葡萄球菌產(chǎn)生，不耐熱，有F和S兩個(gè)組分。細(xì)胞膜上，S組分的受體主要是神經(jīng)節(jié)苷脂GM1；F組分受體則為卵磷脂。,致病原理：殺白細(xì)胞素與受體結(jié)合，改變細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞對(duì)陽離子（K離子）的通透性增加，引起人和動(dòng)物中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的損傷，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。 死亡細(xì)胞可形成膿栓，加重組織感染；大量吞噬細(xì)胞的損傷可影響肌體的免疫防御能力。,

24、四、金黃色葡萄球菌的致病性（ 4.2 致病因子及相應(yīng)致病機(jī)理）,四、金黃色葡萄球菌的致病性（ 4.2 致病因子及相應(yīng)致病機(jī)理）,4.2.3 葡萄球菌腸毒素(staphylococcus enterotoxin, SE),葡萄球菌腸毒素：為血漿凝固酶或耐熱核酸酶陽性菌株產(chǎn)生的一類結(jié)構(gòu)相似、毒力相似、抗原不同的胞外蛋白質(zhì)。,金黃色葡萄球菌是引起食品污染的常見細(xì)菌，被其污染的食品中，在20～37C下經(jīng)4－8h即可產(chǎn)生大量的毒素。約有30～50

25、%的菌株可以產(chǎn)生腸毒素。,基本特性：蛋白質(zhì)，分子量為26KD～30KD，熱穩(wěn)定，100℃30min不被破壞，不受胰蛋白酶影響，能抵抗胃液中蛋白酶的水解作用。,資料報(bào)道，在每100g食物中含有不足18μg的葡萄球菌腸毒素便能引起金黃色葡萄球菌食物中毒癥狀。,四、金黃色葡萄球菌的致病性（ 4.2 致病因子及相應(yīng)致病機(jī)理）,四、金黃色葡萄球菌的致病性（ 4.2 致病因子及相應(yīng)致病機(jī)理）,迄今從血清型上已被鑒定的SE有11種，分別為：A、B、C

26、、D、E、F、G、H、I、J、K型，其中C型又根據(jù)等電點(diǎn)的不同分為3個(gè)亞型（C1、C2、C3）。 各型腸毒素均可引起食物中毒，其中以A型引起的食物中毒最多，B型和C型次之，F(xiàn)型腸毒素是引起毒性休克癥的毒素。,四、金黃色葡萄球菌的致病性（ 4.2 致病因子及相應(yīng)致病機(jī)理）,致病機(jī)理：葡萄球菌腸毒素是一種超抗原，和普通抗原相比，可激活更多的T細(xì)胞，釋放過量的細(xì)胞因子（如INF，IL-1，IFN-γ）而致病。 另外，該毒素在腸

27、道作用于內(nèi)脂神經(jīng)受體，傳入中樞，刺激嘔吐中樞，引起嘔吐，并產(chǎn)生急性胃腸炎癥狀。,四、金黃色葡萄球菌的致病性（ 4.2 致病因子及相應(yīng)致病機(jī)理）,葡萄球菌腸毒素導(dǎo)致的急性腸胃炎病一般潛伏期為1～6小時(shí)，最短者0.5小時(shí)即發(fā)病，出現(xiàn)頭暈、嘔吐、腹瀉等癥狀，發(fā)病1～2日可自行恢復(fù)，預(yù)后良好。,1-6小時(shí),四、金黃色葡萄球菌的致病性（ 4.2 致病因子及相應(yīng)致病機(jī)理）,4.2.4 剝脫毒素（exfoliatin),該毒素由蛋白質(zhì)組成。,致病機(jī)理

28、：具絲氨酸蛋白酶功能，可裂解細(xì)胞間橋小體，破壞細(xì)胞間的連接，引起葡萄球菌燙傷樣皮膚綜合癥（staphylococcal scalded skin syndrome, SSSS)。,四、金黃色葡萄球菌的致病性（ 4.2 致病因子及相應(yīng)致病機(jī)理）,四、金黃色葡萄球菌的致病性（ 4.2 致病因子及相應(yīng)致病機(jī)理）,4.2.5 毒性休克綜合癥毒素1（toxin shock syndrome toxin-1,TSST-1),該毒素也稱致熱外毒素C和

29、腸毒素F，是某些金黃色葡萄球菌在生長(zhǎng)過程中分泌的一種外毒素。該毒性蛋白由細(xì)菌染色體編碼，含有194個(gè)氨基酸，分子量為2.049KD。 毒素結(jié)構(gòu)類似于葡萄球菌腸毒素B，引起發(fā)熱、休克及脫屑性皮疹，稱為毒性休克綜合癥（toxic shock syndrome，TSS）。,致病機(jī)理： ①抑制內(nèi)毒素脫毒或直接損傷肝臟細(xì)胞，使內(nèi)毒素在體內(nèi)蓄積；②刺激單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)釋放血管活性物質(zhì)，干擾心血管系統(tǒng)及血液動(dòng)力學(xué)；③增加毛細(xì)

30、血管通透性，造成心血管功能損傷而導(dǎo)致休克。,四、金黃色葡萄球菌的致病性（ 4.2 致病因子及相應(yīng)致病機(jī)理）,五、金黃色葡萄球菌的檢測(cè),5.1 常用檢測(cè)方法：GB/T4789.10—2008,流程：,五、金黃色葡萄球菌的檢測(cè)（5.1 常用檢測(cè)方法）,S. aureus on Baird-Parker Agar,五、金黃色葡萄球菌的檢測(cè),5.2 金黃色葡萄球菌快速檢測(cè)方法,5.2.1 金黃色葡萄球菌鑒別培養(yǎng)基,Baird-Parker-f-

31、RPF培養(yǎng)基 由法國生物梅里埃公司研制，該培養(yǎng)基是在BP瓊脂的基礎(chǔ)上加入RPF（兔血漿纖維蛋白原）。,該培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富，以氯化鋰代替亞碲酸鉀， 血漿凝固酶陽性的金黃色葡萄球菌，將在培養(yǎng)基中呈現(xiàn)有暈環(huán)的黑色菌落。,五、金黃色葡萄球菌的檢測(cè)（5.2 金黃色葡萄球菌快速檢測(cè)方法）,五、金黃色葡萄球菌的檢測(cè)（5.2 金黃色葡萄球菌快速檢測(cè)方法）,5.2.2 3M金黃色葡萄球菌快速測(cè)試法,原理：Petrifilm.RSA Cou

32、nt Plate由美國3M公司研制生產(chǎn)，是一種薄膜型快速檢測(cè)金黃色葡萄球菌的記數(shù)平板。,3M? Petrifilm? Staph aureus Count,測(cè)試薄膜是由二部分組成。 第一部分是黃金色葡萄球菌培養(yǎng)基片。此培養(yǎng)基中含有經(jīng)修正的Barid-Parker營養(yǎng)成分及冷水可溶解的膠質(zhì)。 第二部分是一種耐熱核酸酶（TNase）反應(yīng)片。含有DNA、甲苯胺藍(lán) ( Toluidine 

33、;Blue-O )及四唑指示劑 (Tetraeolium)，此指示劑有助于菌落的計(jì)數(shù)及確定葡萄球菌耐熱核酸酶的存在。,五、金黃色葡萄球菌的檢測(cè)（5.2 金黃色葡萄球菌快速檢測(cè)方法）,耐熱脫氧核糖核酸酶為產(chǎn)毒金黃色葡萄球菌的典型特征酶，是鑒定金黃色葡萄球菌的標(biāo)志酶之一。 在Petrifilm. RSA 檢測(cè)片上，耐熱DNA酶反應(yīng)呈粉紅色環(huán)帶，包圍著一個(gè)紅色或藍(lán)色的菌落。,五、金黃色葡萄球

34、菌的檢測(cè)（5.2 金黃色葡萄球菌快速檢測(cè)方法）,五、金黃色葡萄球菌的檢測(cè),5.3 金黃色葡萄球菌腸毒素的檢測(cè)方法,5.3.1 動(dòng)物學(xué)試驗(yàn)法,五、金黃色葡萄球菌的檢測(cè)（5.2 金黃色葡萄球菌快速檢測(cè)方法）,5.3.2 血清學(xué)試驗(yàn)法 金黃色葡萄球菌腸毒素為胞外蛋白，為超抗原，可用ELISA法進(jìn)行檢測(cè)。,5.3.3 分子生物學(xué)方法 如：核酸分子雜交法和PCR法?？捎脕頇z測(cè)編碼腸毒素的特異性基因（entA、entB、 entC、

35、entD、entE等）。,六、金黃色葡萄球菌的預(yù)防與控制措施,6.1 防止金黃色葡萄球菌污染食品 ?。?）防止帶菌人群對(duì)各種食物的污染：定期對(duì)生產(chǎn)加工人員進(jìn)行健康檢查，患局部化膿性感染（如疥瘡、手指化膿等）、上呼吸道感染（如鼻竇炎、化膿性肺炎、口腔疾病等）的人員要暫時(shí)停止其工作或調(diào)換崗位。,（2）防止金黃色葡萄球菌對(duì)奶及其制品的污染： 如牛奶廠要定期檢查奶牛的乳房，不能擠用患化膿性乳腺炎的牛奶；奶擠出后，要迅速冷至-10℃以下，以防毒

36、素生成、細(xì)菌繁殖。奶制品要以消毒牛奶為原料，注意低溫保存。,六、金黃色葡萄球菌的預(yù)防與控制措施（6.1 防止金黃色葡萄球菌污染食品 ）,（3）防止金黃色葡萄球菌對(duì)肉及其制品的污染：對(duì)肉制品加工廠，患局部化膿感染的禽、畜尸體應(yīng)除去病變部位，經(jīng)高溫或其他適當(dāng)方式處理后進(jìn)行加工生產(chǎn)。,6.2 防止金黃色葡萄球菌腸毒素的生成 　　應(yīng)在低溫和通風(fēng)良好的條件下貯藏食物，以防腸毒素形成；在氣溫高的春夏季，食物置冷藏或通風(fēng)陰涼地方也不應(yīng)超過6小時(shí)，并

37、且食用前要徹底加熱。,六、金黃色葡萄球菌的預(yù)防與控制措施,第二節(jié) 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌及其食物中毒,一、概論 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（Listeria.monocytohenes）是一種能在冷藏溫度存活的致病菌。 其細(xì)胞的苯酚-水浸出物可以誘導(dǎo)單核細(xì)胞的生成。,一、概論,1891年和1911年：有文獻(xiàn)記載和描述過該細(xì)菌； 1926年：Murray等首次在患病兔和豚鼠肝臟中分離到單核細(xì)胞增生李斯特

38、氏菌； 1929年：最先記錄人類感染單核細(xì)胞增生李斯特氏菌，之后它被確診為引起孕婦產(chǎn)期感染腦膜炎的元兇。,1999年底，美國發(fā)生了歷史上因食用帶有李斯特菌的食品而引發(fā)的最嚴(yán)重的食物中毒事件。 據(jù)美國CDC資料顯示，在美國密歇根州有14人因食用被該菌污染的 “熱狗”和熟肉而死亡，在另外22個(gè)州97人患此病，6名婦女流產(chǎn)。,一、概論,,2001年11月以來，我國質(zhì)檢部門多次在從美國、加拿大、法國、愛爾蘭、比利時(shí)、丹麥等

39、二十多家肉類加工廠進(jìn)口的豬腰、豬肚、豬耳、小排等三十多批近千噸豬副產(chǎn)品中檢出單增李斯特菌、沙門氏菌等致病菌。,一、概論,一、概論,,李斯特氏菌屬有七個(gè)菌種： （1）單核細(xì)胞增生李斯特菌 (L.monocytohenes) （2）綿羊李斯特菌 (L.ivanovii) （3）英諾克李斯特菌 (L.innocua) （4）威爾斯李斯特菌 (L.welshimeri) （5）西爾李斯特菌 (L.seeliger) （6

40、）格氏李斯特菌 (L.grayi) （7）默氏李斯特菌 (L.murrayi),二、生物學(xué)特性,2.1形態(tài)特征,G+，類球形桿菌，大小為（0.4～0.5）um×（0.5～2.0）um，直或彎曲，兩端鈍圓，單個(gè)、呈V字型排列或成隊(duì)排列，兼性厭氧，無芽孢，一般不形成莢膜（營養(yǎng)豐富環(huán)境可形成），陳舊培養(yǎng)物中菌體可呈絲狀、革蘭氏染色陰性，有4根周毛和1根鞭毛，周毛易脫落。,二、生物學(xué)特性,2.2 培養(yǎng)特征,通常在大多數(shù)細(xì)菌培養(yǎng)基上

41、生長(zhǎng)良好。,（1）胰蛋白胨瓊脂 單核細(xì)胞增生李斯特菌最佳培養(yǎng)保存用培養(yǎng)基。形成圓形、光滑、稍扁平的透明菌落。,二、生物學(xué)特性(2.2 培養(yǎng)特征),(2) 在含2.5g/L瓊脂、80g/L明膠和10g/L葡萄糖的半固體培養(yǎng)基中: 37℃培養(yǎng)24h，生長(zhǎng)物沿穿刺線以不規(guī)則云霧狀延伸到培養(yǎng)基內(nèi)，進(jìn)而擴(kuò)散到整個(gè)培養(yǎng)基。生長(zhǎng)達(dá)最高量時(shí)在培養(yǎng)基表面下3～5mm處形成一似傘狀界面。,二、生物學(xué)特性(2.2 培養(yǎng)特征),(3)

42、羊肝浸出液瓊脂 透射光觀察為圓形、光滑、奶油狀、稍扁平菌落；反射光觀察為乳白色菌落。 菌落有光滑型、中間型和粗糙型三種。,（4）血瓊脂平板 菌落周圍有溶血帶或溶血圈。少數(shù)菌株強(qiáng)烈溶血，其余菌株溶血較弱。,A,B,C,二、生物學(xué)特性(2.2 培養(yǎng)特征),該菌生長(zhǎng)需要B族維生素（生長(zhǎng)素、核黃素、硫胺素和硫辛酸）和氨基酸（半胱氨酸、谷氨酰胺、異亮氨酸、亮氨酸等）。 適宜在中性或偏堿性的介質(zhì)中生長(zhǎng)，pH范圍為5.2～

43、9.6，在低于5.2條件下仍可存活數(shù)周到數(shù)月。 抗鹽能力強(qiáng)，在0～4℃條件下，該菌在25.5%NaCl水溶液中可存活數(shù)月。,二、生物學(xué)特性(2.2 培養(yǎng)特征),,單核細(xì)胞增生李斯特菌是嗜冷菌，在0～ 50℃及冰箱溫度下均能生長(zhǎng)。最適生長(zhǎng)溫度為37℃。,Growth and Survival of Listeria at Low Temperatures,二、生物學(xué)特性,2.3 生化特性,李斯特氏菌屬不同種間生化特性,二、生物學(xué)特性

44、（2.3 生化特性）,李斯特氏菌屬不同種間生化特性（續(xù)表）,注：+，90%菌株呈陽性反應(yīng)； －，90%菌株呈陰性反應(yīng)；d，11—89%菌株呈陽性反應(yīng)。,二、生物學(xué)特性,2.4 血清型分類,單核細(xì)胞增生李斯特氏菌具有菌體抗原（O）和鞭毛抗原（H），有13個(gè)血清型，見下表（含其他李斯特菌）：,李斯特氏菌屬不同菌種間血清型分布,二、生物學(xué)特性（2.4 血清型分類）,單增李斯特菌13個(gè)血清型中，其中： 3種（1/2a、1/2b和4b）占臨

45、床感染的90%； 最常見的為1/2b； 通常引起食源性感染的是4b。1966年以來，有記載爆發(fā)的24起單核細(xì)胞增生李斯特氏菌疾病中14起屬于4b，占58%；8起屬于1/2a，占11%。,二、生物學(xué)特性,2.5 抵抗力,對(duì)理化因素抵抗力較強(qiáng)：在土壤、糞便、青儲(chǔ)飼料和干草內(nèi)能長(zhǎng)期存活；,對(duì)堿和鹽抵抗力強(qiáng)：25g/L NaOH中經(jīng)20min才殺死，在200g/L NaCl中4℃可存活8周；,60～70℃加熱5～20min可殺死；

46、 70%酒精、25g/L 石炭酸、 25g/L 福爾馬林20min可殺死； 對(duì)氯霉素、青霉素、氨芐青霉素、四環(huán)素、紅霉素、新霉素和磺胺藥物敏感，抗多粘菌素。,二、生物學(xué)特性（2.5 抵抗力）,三、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的流行病學(xué)與臨床表現(xiàn),在自然界廣泛分布，能耐受較高的滲透壓。 易從健康的人和動(dòng)物體、腐爛的果品蔬菜、土壤、動(dòng)物產(chǎn)品、糞便、青儲(chǔ)飼料、水及水產(chǎn)品等載體中分離。,3.1 分布,,不同載體中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的

47、含菌量或檢出率,三、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的流行病學(xué)與臨床表現(xiàn)（3.1 分布）,三、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的流行病學(xué)與臨床表現(xiàn)（3.1 分布）,不同載體中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的含菌量或檢出率（續(xù)表）,3.2單核細(xì)胞增生李斯特氏菌污染食品造成的感染,帶菌食品類型： 軟奶酪、未充分加熱的雞肉、未再次加熱的熱狗、鮮牛奶、巴氏消毒奶、冰淇淋、生牛排、羊排、卷心菜沙拉、芹菜、番茄、法式餡餅和凍豬舌等。,三、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的流行病學(xué)

48、與臨床表現(xiàn),三、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的流行病學(xué)與臨床表現(xiàn)（3.1 分布）,途徑一：通過糞—口途徑進(jìn)行傳播（主要途徑）；,傳播途徑：,途徑二：該菌還可通過眼睛及損傷皮膚、黏膜進(jìn)入人體內(nèi)而造成感染；孕婦感染后通過胎盤或產(chǎn)道感染胎兒或新生兒；性接觸也是本病傳播的可能途徑，且呈上升趨勢(shì)。,,傳播途徑及感染類型：,,,,,,三、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的流行病學(xué)與臨床表現(xiàn)（3.2 傳播和感染）,3.3 流行病學(xué) 人類感染單核細(xì)胞增生李斯

49、特氏菌發(fā)病率為：2～15人/100 0000人，死亡率約為30%左右；通常免疫力低下、老人和感染菌血癥的嬰兒死亡率較高，有報(bào)道可高達(dá)75%。,三、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的流行病學(xué)與臨床表現(xiàn),單核細(xì)胞增生李斯特氏菌引起的部分食源性疾病爆發(fā),三、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的流行病學(xué)與臨床表現(xiàn)（3.3 流行病學(xué)）,三、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的流行病學(xué)與臨床表現(xiàn),3.4 臨床癥狀,典型癥狀一: 個(gè)體免疫機(jī)能受損引起的感染，如：

50、 ①似流感樣癥（畏寒、發(fā)熱、頭痛和血尿等），死亡率較高，甚至達(dá)30%； ② 流產(chǎn)； ③死胎；④膿血癥；⑤腦膜炎,癥狀二：溫和性胃腸炎癥狀,四、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的致病因子及致病機(jī)理,4.1 細(xì)菌的毒力島 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌毒力島：又稱致病島，是指編碼該菌毒力基因簇的相對(duì)分子量比較大的染色體DNA片段。 特點(diǎn)：兩側(cè)一般具有重復(fù)序列和插入元件，通常位于細(xì)菌染色體

51、tRNA基因位點(diǎn)內(nèi)或附近，不穩(wěn)定，含有潛在的可移動(dòng)元件。 基因產(chǎn)物：分泌性蛋白或細(xì)菌表面蛋白。,四、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的致病因子及致病機(jī)理(4.1細(xì)菌的毒力島 ）,編碼LM相關(guān)致病性的毒力基因有兩簇，稱單核細(xì)胞增生李斯特氏菌毒力島LIPI-1和單核細(xì)胞增生李斯特氏菌毒力島LIPI-2。4.1.1 毒力島LIPI-1及相關(guān)基因功能 位于9kb大小的染色體上，其兩側(cè)分別為prs和ldh位點(diǎn)，有6個(gè)基因，從p

52、rs下游開始，依次為prfA、plcA、hly、mpl、actA和plcB。,mpl-actA-plcB： 位于hly下游。Mpl基因產(chǎn)物mpl蛋白加工酶，為鋅依賴蛋白酶，能起到外毒素作用； actA基因編碼表面蛋白ActA，與細(xì)菌肌動(dòng)蛋白聚合性運(yùn)動(dòng)有關(guān)，也與細(xì)菌被宿主細(xì)胞內(nèi)化有關(guān)。,四、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的致病因子及致病機(jī)理(4.1細(xì)菌的毒力島 ）,3種基因產(chǎn)物可使李斯特菌在宿主細(xì)胞與細(xì)胞之間互相傳遞，可有效避免宿

53、主免疫系統(tǒng)體液效應(yīng)蛋白損傷。,plcB基因編碼磷酸酯酶C，能水解宿主細(xì)胞上大多數(shù)的磷脂。,四、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的致病因子及致病機(jī)理(4.1細(xì)菌的毒力島 ）,Hly基因： 編碼Hly蛋白，大小60kD，稱為單核細(xì)胞增生李斯特氏菌溶解素（listeriolysin O),是一種孔形成毒素（pore-forming-toxin），能破壞吞噬體，促使菌體進(jìn)入胞液，是細(xì)菌在胞液內(nèi)增殖的先決條件，是主要的毒力因子，其缺失將使細(xì)

54、菌毒力因子全部喪失。,,四、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的致病因子及致病機(jī)理(4.1細(xì)菌的毒力島 ）,plcA-prfA基因： 位于hly基因上游，plcA編碼plcA磷脂酰肌醇-特異性磷脂酶C；prfA編碼prfA蛋白，是李斯特菌所有基因簇包括prfA本身轉(zhuǎn)錄激活所必須，是李斯特菌唯一的毒力因子調(diào)節(jié)蛋白。,四、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的致病因子及致病機(jī)理(4.1細(xì)菌的毒力島 ）,4.1.2 毒力島LIPI-2及相關(guān)基因功能,LI

55、PI-2又稱內(nèi)化素小島（internalin islets)，它是一個(gè)富含亮氨酸重復(fù)序列的蛋白質(zhì)家族。LM的內(nèi)化素分兩個(gè)型： 其一為相對(duì)分子量大的蛋白質(zhì)組成，通過其C-末端區(qū)黏附于細(xì)菌細(xì)胞壁上。此亞族代表是inlAB編碼的InlA和InlB多肽。,四、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的致病因子及致病機(jī)理(4.1細(xì)菌的毒力島 ）,,另一亞族由相對(duì)分子量較小的蛋白質(zhì)組成，他們?nèi)狈-末端細(xì)胞壁錨定區(qū)而釋放于胞外環(huán)境。 LIPI-2在

56、LM侵入宿主細(xì)胞的過程中起關(guān)鍵性作用，但目前仍不清楚其對(duì)LM致病的確切機(jī)理。,四、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的致病因子及致病機(jī)理(4.1細(xì)菌的毒力島 ）,4.2 低溫生長(zhǎng)和耐酸特性,LM在食源性疾病傳播中的顯著特點(diǎn)之一是可在低溫條件下生長(zhǎng)繁殖。 分子生物學(xué)研究表明：該菌能表達(dá)四種不同的應(yīng)激蛋白，即HrcA 、sigmaB、Clp家族和所謂的第四類基因編碼的三個(gè)冷休克蛋白。 近年來細(xì)菌的抗酸基因gad也被發(fā)現(xiàn)，其表達(dá)的蛋白能分

57、解膽鹽，從而有利于細(xì)菌在哺乳動(dòng)物腸道存活。,四、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的致病因子及致病機(jī)理,4.3黏附與侵襲 LM能黏附和進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞。 LM通過表面的D-半乳糖殘基與宿主細(xì)胞的D-半乳糖受體接合，可使細(xì)菌吸附在消化道的上皮細(xì)胞上。其侵入可能是從腸道黏膜到達(dá)下層組織。,四、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的致病因子及致病機(jī)理,4.4 破壞宿主免疫,LM在宿主體內(nèi)感染途徑：,口（食物）,,胃腸道感染,,侵入上皮細(xì)胞后被單核巨噬細(xì)胞吞

58、噬,隨巨噬細(xì)胞擴(kuò)散到局部淋巴結(jié),,,到達(dá)內(nèi)臟器官,四、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的致病因子及致病機(jī)理,LM 侵入肌體后可在單核巨噬細(xì)胞、肝細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞等多種細(xì)胞內(nèi)存活，生長(zhǎng)和繁殖，誘導(dǎo)以CD8+H和CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的特異性免疫應(yīng)答。如CD4+誘導(dǎo)生成淋巴因子（特別是干擾素），CD8+直接裂解感染細(xì)胞。 但由于LM能在宿主細(xì)胞間生長(zhǎng)繁殖，因而在很大程度上防止了宿主體液免疫的裂解反應(yīng)。,四、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的

59、致病因子及致病機(jī)理（4.4 破壞宿主免疫）,五、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的檢測(cè),5.1 常用檢測(cè)方法GB/T 4789.30—2003；SN 0184—1993美國FDA一次性增菌檢測(cè)方法美國USDA/FSIS檢測(cè)方法ISO檢測(cè)方法,五、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的檢測(cè)（5.1 常用檢測(cè)方法）,舉例：5.1.1 GB/T 4789.30-2003 食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 單核細(xì)胞增生李斯特氏

60、菌檢驗(yàn),檢樣25g(ml),,,,,EB增菌液225ml,LB1增菌液225ml,LB2增菌液10ml,選擇性培養(yǎng)基（MMA）,,,,,,,30℃ 48h,30℃ 24h,30℃ 24h,,增菌,五、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的檢測(cè)（5.1 常用檢測(cè)方法）,選擇性培養(yǎng)基（MMA）,,,,,SIM動(dòng)力培養(yǎng)基,TSI瓊脂,,,,,TSA-YE培養(yǎng)基,,,,革蘭氏染色,運(yùn)動(dòng)性觀察,,MR，VP實(shí)驗(yàn),硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn),過氧化氫酶實(shí)驗(yàn),甘露醇,木糖醇,

61、鼠李糖,七葉苷,溶血試驗(yàn),協(xié)同溶血試驗(yàn),小鼠致病力試驗(yàn),,,,,,,,,,,30℃ 24h,30℃ 24h,25℃ 2～5d（傘狀）,30℃ 24～48h,5.1.2 FDA檢測(cè)方法—一次增菌培養(yǎng)檢測(cè)法,檢樣25g(ml),增菌肉湯225ml,LPM培養(yǎng)基,Oxford培養(yǎng)基,解剖鏡鏡檢,TSA-YE培養(yǎng)基,可疑菌落,生理生化試驗(yàn)及形態(tài)檢驗(yàn),,,,,,,,,,,,,30℃，24～48h,35℃，24～48h,30℃，24～48h,五、單

62、核細(xì)胞增生李斯特氏菌的檢測(cè)（5.1 常用檢測(cè)方法）,Oxford-Agar mit Kolonien von Listeria monocytogenes,30℃，24～48h,五、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的檢測(cè),5.2 基于免疫學(xué)原理的檢測(cè)技術(shù),原理：ELISA應(yīng)用舉例： FDA批準(zhǔn)使用的有Listeria-Tek ELISA和TECHRA可見免疫沉淀試劑盒； 加拿大食品檢驗(yàn)局(CFIA)批準(zhǔn)使用VIDAS

63、TM（bioMerieux)LMO1試劑盒和Oxoid Listeria Rapid Test(Clearview)試劑盒檢測(cè)李斯特氏菌屬的菌種；,2003年3月，加拿大批準(zhǔn)了VIDASTM（bioMerieux)LMO2用于單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢測(cè)； 2003年，加拿大CFIA 批準(zhǔn)了BioControl system Inc生產(chǎn)的可見免疫沉淀檢測(cè)試劑盒用于李斯特氏菌屬檢測(cè)。,五、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的檢測(cè)（5.

64、2 基于免疫學(xué)原理的檢測(cè)技術(shù)）,五、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的檢測(cè),5.3 基于分子生物學(xué)原理的檢驗(yàn)技術(shù),5.3.1 核酸分子雜交法舉例 美國USDA/FSIS和加拿大CFIA都批準(zhǔn)使用AccuprobeTM檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的試劑盒。,DNA探針（化學(xué)熒光物質(zhì)丫啶黃嘌呤標(biāo)記）,目標(biāo)菌核糖體RNA,,雜交,,DNA-RNA,,,DNA探針,堿性條件下，標(biāo)記物與過氧化氫作用產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光,,內(nèi)酯鍵被水解，不發(fā)光,,用Gen

65、-Probe光度計(jì)檢測(cè),,,五、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的檢測(cè)（5.3 基于分子生物學(xué)原理的檢驗(yàn)技術(shù)）,5.3.2 PCR擴(kuò)增法,加拿大CFIA批準(zhǔn)使用PCR檢測(cè)在相關(guān)選擇性培養(yǎng)基上得到的可疑單核細(xì)胞增生李斯特氏菌菌落。 公布的官方擴(kuò)增基因?yàn)閔lyA基因，引物核酸序列為：F：5’-CATTAGTGGAAAGATGGAATG-3’R：5’-GTATCCTCCAGAGTGATCG-3’ 目標(biāo)DNA大小為730bp.,

66、五、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的檢測(cè)（5.3 基于分子生物學(xué)原理的檢驗(yàn)技術(shù)）,5.3.3 Real-Time PCR,Real time PCR:即實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物并進(jìn)行解析的方法。 是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光物質(zhì)，并通過Real time PCR檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)PCR反應(yīng)進(jìn)程中的熒光信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，最終對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理的方法。,Advantages:(1) Allows us to actually view

67、 the increase in the amount of DNA as it is amplified(2) Quantitative(3) No need to run gels: rapid and simpler(4) Multiplexing ( > 1 target per reaction),五、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的檢測(cè)（5.3 基于分子生物學(xué)原理的檢驗(yàn)技術(shù)）,五、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的檢測(cè)

68、（5.3 基于分子生物學(xué)原理的檢驗(yàn)技術(shù)）,Molecular Beacon Technology,Detection of PCR product by molecular beacon,Molecular beacon,TaqMan® real-time PCR,,Probe with quenching dye and reporter dye,Probe and primer bind target DNA,Rep