反義抑制鯊烯合酶基因表達對產(chǎn)紫穗槐烯酵母工程菌生物合成的影響.pdf

1、青蒿素是目前治療瘧疾的首選藥物，但天然來源受到多種因素制約，通過基因工程方法生產(chǎn)其中間體青蒿酸、進而化學(xué)半合成青蒿素是解決資源問題的重要途徑之一。為構(gòu)建青蒿酸高產(chǎn)酵母工程株系，本論文開展了紫穗槐-4，11-二烯(簡稱：紫穗槐烯，AD)的生物合成途徑工程研究并取得如下進展： 1.ADS整合型釀酒酵母工程菌的構(gòu)建：根據(jù)同源雙交換的原理，構(gòu)建可以在釀酒酵母的λDNA序列處進行雙交換的紫穗槐-4，11-二烯合酶(ADS)基因(ADS)的

2、整合載體。λDNA序列在釀酒酵母基因組中大約有200個拷貝，把外源基因整合在這個位點可以大大提高外源基因在釀酒酵母中表達的拷貝數(shù)。構(gòu)建ADS整合載體首先要把釀酒酵母的強啟動子ADH和終止子連在載體上，然后把ADS基因亞克隆到強啟動子ADH和終止子之間，再連接一個營養(yǎng)缺陷型篩選標記基因URA3，還要把λDNA序列分成兩個交換臂連在所有待整合基因的兩端。用這個構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)化營養(yǎng)缺陷型釀酒酵母，篩選出ADS整合型工程菌。得到的菌株經(jīng)過發(fā)酵培

3、養(yǎng)后，用GC-MS檢測發(fā)酵產(chǎn)物，經(jīng)過計算，其中一株工程菌產(chǎn)紫穗槐烯的量達到117.0mg·L-1。 2.ADS整合型工程菌和ADS附加體型工程菌AD產(chǎn)率比較：將本論文構(gòu)建的ADS整合型工程菌和實驗室以前構(gòu)建的ADS附加體型工程菌各選3株，同時發(fā)酵培養(yǎng)，然后進行發(fā)酵液提取和GC-MS檢測。結(jié)果顯示，整合型工程菌的AD產(chǎn)率明顯高于附加體型工程菌的AD產(chǎn)率(P＜0.01)。 3.鯊烯合酶基因(SQS)反義RNA表達載體的構(gòu)建：

4、設(shè)計反義RNA時，人們普遍應(yīng)用由翻譯起始位點向上下游延伸0.5kb-3.0kb的片段作為重組質(zhì)粒的逆向插入序列，5’和3’非翻譯區(qū)(UTR)往往具有良好的效果。本研究把SOSmRNA的4個基因片段：SQS1(5’-UTR)，SQS7(3’-UTR)，SQS3﹡4.(5’UTR加5’編碼區(qū))以及SQS5﹡6(3’-編碼區(qū)加3'-UTR)分別反向插入到pYeDP60的GAL10/CYC1半乳糖誘導(dǎo)型啟動子的下游，構(gòu)建成4個相應(yīng)的SOS反義R

5、NA表達載體pYeD/SQS1、pYeD/SQS7、pYeD/SQS3﹡4、pYeD/SQS5*6。 4.SQS反義RNA表達對AD釀酒酵母工程菌生物合成的影響：用上述4個SQS反義RNA表達載體分別轉(zhuǎn)化ADS整合型酵母工程菌，得到含有SQS反義RNA的ADS酵母工程菌。用GC-MS檢測發(fā)酵產(chǎn)物中的AD和鯊烯(SQ)的量，初步研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)入SQS反義表達載體后，鯊烯(SQ)和AD的產(chǎn)率比轉(zhuǎn)入前均有所下降。可能的原因是：所分析的重

6、組菌樣本量比較少，而這些重組菌中轉(zhuǎn)入的反義基因片段除了引起SQS表達下調(diào)以外，還引起ADS表達的部分抑制。 本論文還開展了重組SARS未知功能小蛋白的大腸桿菌表達、純化及抗體制備研究： 5.SARS-CoV未知功能小蛋白的表達、純化、鑒定及抗體制備：在大腸桿菌BL21trxB(DE3)中，表達了重組SARS-CoV未知功能小蛋白X4、X5和ORF10。對X5和ORF10重組蛋白進行了Ni+親和層析純化。ORF10純化時，

7、用低濃度咪唑(60mM·L-1)梯度洗脫，獲得22KD和44KD兩個蛋白條帶；在用高濃度咪唑(120mM·L-1)梯度洗脫時，只有分子量大小為22KD的蛋白條帶。制備這兩種條帶并送中國科學(xué)院生物物理研究所進行LC-MS/MS測定，結(jié)果顯示：在22KD和44KD兩種蛋白樣品中均能檢測到與ORF10蛋白序列100％同源的若干個片段，兩種樣品所測得的片段分別占總ORF10蛋白序列理論值的38.3％和45.1％，由此推測：所獲得的重組蛋白就是O

8、RF10蛋白，其中44KD的蛋白條帶可能是該蛋白的二聚體的形式，這也很可能是病毒進入人體后起作用的形式。 在純化X5蛋白時，用和ORF10一樣的純化方法卻沒有得到X5蛋白，推測X5蛋白是以包涵體形式存在。用尿素變性溶解包涵體，然后所得上清用親和柱層析，Tris緩沖液復(fù)性的辦法得到了高產(chǎn)率、高純度的蛋白。用復(fù)性后的蛋白免疫兔子得到了高效價的X5蛋白的抗血清。Western免疫印跡顯示尿素變性純化再復(fù)性的X5蛋白的抗體能夠和菌體中表