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文檔簡介
1、目的:克隆刺五加(Eleutherococcus senticosus)內生真菌青霉(Penicillium minioluteum)的鯊烯合酶基因(Squalene synthase, SS)。構建鯊烯合酶基因原核表達載體,并進行原核表達。利用紅色熒光蛋白,對鯊烯合酶進行定位。分析 SS密碼子的使用方式及其影響因素。
方法:經過 PCR擴增 PmSS的保守序列,5’RACE擴增5’端未知序列。經過拼接獲得PmSS的全長基因序
2、列,并構建PmSS基因克隆質粒。經過雙酶切PmSS和原核表達質粒pET-30a(+),連接后,克隆質粒經過雙酶切并回收后,將目的片段連接于表達載體后,轉化原核表達宿主 BL21(DE3)。在不同條件下誘導表達,篩選適宜的表達條件,在20℃~37℃的不同的溫度和0.2mmol/L~1.2 mmol/L的不同的IPTG誘導濃度對 SS蛋白進行誘導表達,表達產物經蛋白提取試劑盒提取后進行SDS-PAGE分析蛋白表達情況。PmSS基因克隆質粒通
3、過雙酶切回收后連接于熒光表達載體 pEGFP-N1和pDsRed2-N1中,將連接好的質粒轉化 P. minioluteum,以確定SS蛋白的定位。利用codon W、CUSP分析47條來自不同物種的鯊烯合酶基因并用SPSS16.0軟件進行多元統(tǒng)計分析、對應性分析對其進行分析,和以MEGA5.0的neighbor-joining連接法構建的系統(tǒng)發(fā)育樹進行比較。
結果:克隆獲得的PmSS基因全長為1881 bp,包含1413 b
4、p的開放閱讀框,預測的蛋白三維結構包含保守序列和活性氨基酸殘基。構建的P. Minioluteum的SS基因的原核表達載體在原核表達宿主 BL21(DE3)中進行了表達,同時對表達條件進行優(yōu)化,在溫度為30℃時表達量更高,IPTG誘導濃度為0.6 mmol/L時表達量更高。在 P. minioluteum中 SS呈點狀或面狀集中分布于內質網上。鯊烯合酶基因密碼子1~3位堿基的GC含量(GC1,GC2和GC3)依次為51.33%、34.6
5、5%和54.37%,3個位點的GC含量均呈極顯著相關關系(P<0.01),對應性分析的結果表明,第1軸顯示30.71%的差異,有效密碼子數和GC3、GC1和GC2的均值與GC3之間的相關性均達極顯著水平(P<0.01)。從不同物種的SS中篩選出的最優(yōu)密碼子為26個密碼子,第3位堿基均為G或C。以MEGA5.0構建的基于鯊烯合酶蛋白質序列的進化樹和基于 RSCU的聚類分析輸出的樹狀圖相比,不同算法的聚類結果一致。
結論:實驗成功
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