刺五加內生青霉鯊烯合酶基因的克隆和表達.pdf

1、目的：克隆刺五加（Eleutherococcus senticosus）內生真菌青霉（Penicillium minioluteum）的鯊烯合酶基因(Squalene synthase, SS）。構建鯊烯合酶基因原核表達載體，并進行原核表達。利用紅色熒光蛋白，對鯊烯合酶進行定位。分析 SS密碼子的使用方式及其影響因素。
　　方法：經過 PCR擴增 PmSS的保守序列，5’RACE擴增5’端未知序列。經過拼接獲得PmSS的全長基因序

2、列，并構建PmSS基因克隆質粒。經過雙酶切PmSS和原核表達質粒pET-30a(+)，連接后，克隆質粒經過雙酶切并回收后，將目的片段連接于表達載體后，轉化原核表達宿主 BL21(DE3)。在不同條件下誘導表達，篩選適宜的表達條件，在20℃～37℃的不同的溫度和0.2mmol/L～1.2 mmol/L的不同的IPTG誘導濃度對 SS蛋白進行誘導表達，表達產物經蛋白提取試劑盒提取后進行SDS-PAGE分析蛋白表達情況。PmSS基因克隆質粒通

3、過雙酶切回收后連接于熒光表達載體 pEGFP-N1和pDsRed2-N1中，將連接好的質粒轉化 P. minioluteum，以確定SS蛋白的定位。利用codon W、CUSP分析47條來自不同物種的鯊烯合酶基因并用SPSS16.0軟件進行多元統(tǒng)計分析、對應性分析對其進行分析，和以MEGA5.0的neighbor-joining連接法構建的系統(tǒng)發(fā)育樹進行比較。
　　結果：克隆獲得的PmSS基因全長為1881 bp，包含1413 b

4、p的開放閱讀框，預測的蛋白三維結構包含保守序列和活性氨基酸殘基。構建的P. Minioluteum的SS基因的原核表達載體在原核表達宿主 BL21(DE3)中進行了表達，同時對表達條件進行優(yōu)化，在溫度為30℃時表達量更高，IPTG誘導濃度為0.6 mmol/L時表達量更高。在 P. minioluteum中 SS呈點狀或面狀集中分布于內質網上。鯊烯合酶基因密碼子1~3位堿基的GC含量（GC1，GC2和GC3）依次為51.33％、34.6

5、5%和54.37%，3個位點的GC含量均呈極顯著相關關系（P<0.01），對應性分析的結果表明，第1軸顯示30.71%的差異，有效密碼子數和GC3、GC1和GC2的均值與GC3之間的相關性均達極顯著水平（P<0.01）。從不同物種的SS中篩選出的最優(yōu)密碼子為26個密碼子，第3位堿基均為G或C。以MEGA5.0構建的基于鯊烯合酶蛋白質序列的進化樹和基于 RSCU的聚類分析輸出的樹狀圖相比，不同算法的聚類結果一致。
　　結論：實驗成功