KLF4在富集結(jié)腸癌干細胞的球細胞中發(fā)揮原癌作用.pdf

1、背景:結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移、復發(fā)嚴重制約著臨床療效,目前對于其機制尚不明確。腫瘤干細胞理論認為,腫瘤干細胞的自我更新和分化能力決定著腫瘤的轉(zhuǎn)歸,介導其轉(zhuǎn)移、復發(fā)等行為。核轉(zhuǎn)錄因子KLF4(Krüppel-likefactor4)在維持干細胞的自我更新和分化過程中發(fā)揮關鍵作用。而正常干細胞與腫瘤干細胞極為相似,所以有必要明確KLF4在正常干細胞與腫瘤干細胞中是否存在相同或相似的調(diào)控機制。在結(jié)腸癌中KLF4被認為是抑癌基因,但是這些報道都基于臨床及

2、普通結(jié)腸癌細胞研究,目前還未見KLF4在結(jié)腸癌腫瘤干細胞中的表達及功能研究。我們發(fā)現(xiàn),KLF4高表達于富集腫瘤干細胞的細胞群中?？紤]到KLF4在維持干細胞自我更新過程中發(fā)揮的關鍵作用,則其在結(jié)腸癌干細胞中是繼續(xù)發(fā)揮抑癌效應還是作為原癌基因維持其自我更新?
　　目的:明確KLF4表達變化對富集結(jié)腸癌干細胞的球細胞惡性行為的影響,以期揭示KLF4在結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移、復發(fā)中的作用。
　　方法:Real-timePCR、Western-b

3、lot檢測結(jié)腸癌細胞系及正常結(jié)腸上皮細胞FHC中KLF4表達情況。將結(jié)腸癌DLD-1細胞行無血清培養(yǎng)獲得DLD-S球細胞,檢測其中KLF4、結(jié)腸癌干細胞基因的表達;Transwell檢測轉(zhuǎn)移、侵襲能力;裸鼠皮下成瘤實驗及軟瓊脂克隆、平板克隆實驗檢測體內(nèi)外成瘤能力;CCK-8法檢測耐藥能力變化。免疫磁珠法分選CD133+及CD133-細胞,Real-timePCR檢測其中KLF4表達差異。免疫熒光檢測KLF4與CD133在DLD-1及DL

4、D-S中的表達。設計KLF4shRNA慢病毒載體,轉(zhuǎn)染球細胞后檢測KLF4、結(jié)腸癌干細胞基因的表達及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關基因表達變化;流式細胞術檢測CD133+細胞比例變化;細胞再次行無血清培養(yǎng)檢測其自我更新能力差異;再次檢測細胞轉(zhuǎn)移、侵襲、體內(nèi)外成瘤能力、耐藥能力變化。
　　結(jié)果:相對于正常結(jié)腸上皮FHC,結(jié)腸癌中KLF4表達量低(P<0.05)。相比DLD-1,DLD-S中KLF4、結(jié)腸癌干細胞基因表達明顯升高(P<0.05);D

5、LD-S細胞已發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(P<0.05);球細胞表現(xiàn)出更強的侵襲、轉(zhuǎn)移、耐藥及體內(nèi)外成瘤能力(P<0.05);相較于CD133-細胞,CD133+細胞中KLF4也明顯升高(P<0.05);免疫熒光也證實KLF4與CD133共同表達在DLD-S細胞中;沉默DLD-S中KLF4表達后,KLF4、CD133、CD166、Lgr5、ALDH1表達均下降(P<0.05);CD133+細胞比例下降(P<0.05);侵襲、轉(zhuǎn)移、耐藥及體內(nèi)外成瘤