結(jié)腸癌干細(xì)胞分選、差異microRNA表達(dá)譜檢測(cè)以及miR-449b-CCND1、E2F3通路在結(jié)腸癌干細(xì)胞自我更新的機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　本課題擬通過Real time-PCR、基因轉(zhuǎn)染、熒光素酶系統(tǒng)驗(yàn)證、基因芯片等分子生物學(xué)手段，探尋miR-449b在結(jié)腸癌干細(xì)胞中的差異表達(dá)和變化，并通過生物信息學(xué)方法挖掘和確證其相應(yīng)的靶基因，建立結(jié)腸癌干細(xì)胞生物發(fā)育的特異信號(hào)調(diào)控通路。通過這些方面的深入研究，有助于揭示結(jié)腸癌干細(xì)胞發(fā)生發(fā)育學(xué)的microRNA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控機(jī)制，為大腸癌防治提供新的治療靶點(diǎn)和策略。
　　方法：
　　(1)首先進(jìn)行結(jié)腸癌干細(xì)胞

2、的分選和鑒定。根據(jù)目前公認(rèn)的結(jié)腸癌干細(xì)胞表面分選標(biāo)志CD133分子和CD44分子，通過流式細(xì)胞儀分離篩選結(jié)腸癌細(xì)胞株中CD133+CD44+雙陽(yáng)性腫瘤干細(xì)胞和CD133-CD44-雙陰性細(xì)胞。采用流式細(xì)胞術(shù)、Western-blot等方法，對(duì)結(jié)腸癌腫瘤干細(xì)胞的特性進(jìn)行鑒定。(2)microRNA在結(jié)腸癌干細(xì)胞中的差異表達(dá)確證。對(duì)分離的結(jié)腸癌干細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增:無血清培養(yǎng)技術(shù)擴(kuò)增獲取結(jié)腸癌干細(xì)胞。對(duì)兩組CD133+CD44+雙陽(yáng)性腫瘤干細(xì)胞和

3、CD133-CD44-雙陰性細(xì)胞的總RNA的提取。并利用microRNA芯片比較CD133+CD44+雙陽(yáng)性腫瘤干細(xì)胞和CD133-CD44-雙陰性細(xì)胞的microRNA表達(dá)譜。挑選出有意義的差異表達(dá)的microRNA。(3)綜合mRNA數(shù)據(jù)庫(kù)、microRNA數(shù)據(jù)庫(kù)、生物信息學(xué)技術(shù)分析預(yù)測(cè)候選miR-449b的靶基因mRNA。利用基因芯片比較CD133+CD44+雙陽(yáng)性腫瘤干細(xì)胞和CD133-CD44-雙陰性細(xì)胞的mRNA表達(dá)譜。對(duì)差

4、異基因數(shù)據(jù)進(jìn)行基因本體論（GeneOntology，GO）分析、信號(hào)通路(Pathway)分析、Path-Net的構(gòu)建、動(dòng)態(tài)基因關(guān)系網(wǎng)絡(luò)(Dynamic-Gene-Net)的構(gòu)建。對(duì)差異microRNA進(jìn)行STC分析、GO分析、Pathway分析、Path-Net的構(gòu)建。差異microRNA進(jìn)行靶基因的預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)靶基因的數(shù)據(jù)庫(kù):TargetScan。差異microRNA預(yù)測(cè)的靶基因與差異基因取交集，microRNA和靶基因的負(fù)相關(guān)分析。

5、(4)利用pMIR-REPORTTM microRNA表達(dá)熒光素酶(luciferase)報(bào)告系統(tǒng)驗(yàn)證差異表達(dá)的microRNA:靶mRNAs相互作用靶位點(diǎn)。(5)利用microRNA抑制劑及pre-microRNA、表達(dá)載體轉(zhuǎn)染，進(jìn)行microRNA分子功能的阻斷和/或再現(xiàn)，研究結(jié)腸癌干細(xì)胞差異表達(dá)microRNA--CCND1、E2F3通路分子的表型改變，解析差異表達(dá)microRNA--CCND1、E2F3通路調(diào)控結(jié)腸癌干細(xì)胞的增殖

6、分化功能。
　　結(jié)果：
　　(1)我們通過使用公認(rèn)的結(jié)腸癌干細(xì)胞表面分選標(biāo)志CD133分子CD44分子篩選出結(jié)腸癌細(xì)胞株中CD133+和CD44+雙陽(yáng)性腫瘤干細(xì)胞和CD133-和CD44-雙陰性細(xì)胞。對(duì)腫瘤干細(xì)胞在無血清培養(yǎng)擴(kuò)增后的表面分子CD133和CD44進(jìn)行了驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)我們分選的結(jié)腸癌干細(xì)胞表面CD133和CD44分布集中、表達(dá)水平高，我們對(duì)于細(xì)胞的公認(rèn)的干性表達(dá)指標(biāo)Bmi1和Oct4進(jìn)行了確證，發(fā)現(xiàn)在我們分選的結(jié)腸癌

7、干細(xì)胞中Bmi1和Oct4的表達(dá)水平顯著增高(p＜0.05)。(2)我們通過microRNA和mRNA表達(dá)譜芯片比較CD133+和CD44+雙陽(yáng)性腫瘤干細(xì)胞和CD133-和CD44-雙陰性細(xì)胞的microRNA表達(dá)譜和mRNA表達(dá)譜，我們發(fā)現(xiàn)各有31個(gè)microRNA的表達(dá)值顯著升高和顯著降低，各有14個(gè)mRNA的表達(dá)值升高10倍以上或值降低10倍以上。并且確證了差異表達(dá)的miR-449b、miR-29a、miR-29b等的表達(dá)水平(p

8、＜0.05)，確證了差異表達(dá)的基因NRAS、FOS、WASF2、COL5A1、CDK6、CCND1等的表達(dá)水平(p＜0.05)。(3)使用人類基因數(shù)據(jù)庫(kù)、microRNA數(shù)據(jù)庫(kù)、生物信息學(xué)技術(shù)（KEGG等）分析，通過計(jì)算機(jī)分析發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸癌干細(xì)胞與非干細(xì)胞中有mi-29a、miR-29b、miR-4524、miR-449b和miR-31等處于關(guān)鍵的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)樞紐性地位(p＜0.05)。并且建立了差異microRNA與差異表達(dá)mRNA之間的G

9、O分析、Pathway分析、Path-Net圖。(4)根據(jù)生物信息學(xué)分析的結(jié)果，我們使用熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)驗(yàn)證了miR449b與CCND1和E2F3之間的相互作用的關(guān)系。我們發(fā)現(xiàn)只有在miR-449b與CCND1和E2F3的非突變體的實(shí)驗(yàn)組中，熒光值下降明顯（p分別為0.019和0.013）。(5)驗(yàn)證了miR-449b通過作用于CCND1和E2F3靶點(diǎn)，調(diào)節(jié)結(jié)腸癌干細(xì)胞自我更新的功能，我們使用MTT實(shí)驗(yàn)測(cè)定miR-449b對(duì)結(jié)腸癌干細(xì)胞

10、自我更新能力的調(diào)控能力。我們發(fā)現(xiàn)在miR-449b高表達(dá)組，結(jié)腸癌干細(xì)胞的MTT值明顯下降(p=0.010)。我們使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期的改變，我們發(fā)現(xiàn)在miR-449b高表達(dá)組停滯在細(xì)胞周期的G0-G1階段的細(xì)胞數(shù)目增加，處于S期的細(xì)胞數(shù)目減少。我們檢測(cè)與CCND1和E2F3相關(guān)的細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，發(fā)現(xiàn)P53和CDK4在miR-449b高表達(dá)組分別表現(xiàn)為增高和降低，在miR-449b低表達(dá)組有相反表達(dá)趨勢(shì)?？偟膩碚f，miR-449

11、b通過抑制CCND1和E2F3基因的表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展起著抑癌基因的作用。
　　結(jié)論：
　　(1)miR-449b在結(jié)腸癌干細(xì)胞系內(nèi)的表達(dá)水平下調(diào)，這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果之前罕有文獻(xiàn)報(bào)道。(2)繪制了結(jié)腸癌干細(xì)胞差異表達(dá)microRNA與靶基因關(guān)系圖，提示了結(jié)腸癌干細(xì)胞中包括細(xì)胞周期，能量代謝，細(xì)胞膜連接等多種功能表達(dá)相關(guān)的差異。(3)miR-449b對(duì)結(jié)腸癌干細(xì)胞的自我更新起到抑制作用，提示miR-449b分子在結(jié)腸癌發(fā)病中起著