酵母雙雜交技術(shù)篩選Cpn0147和Cpn0308配體的研究.pdf

1、肺炎衣原體(Chlamydia pneumonia, Cpn)是一類嚴(yán)格的細(xì)胞內(nèi)生長并具有獨(dú)特的二相發(fā)育周期的病原微生物，主要引起呼吸道和肺部感染，并與心腦血管疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)?，F(xiàn)有研究顯示部分衣原體基因編碼的分泌性蛋白以及包涵體膜蛋白(inclusionprotein，Inc)在衣原體的一系列生命活動過程中扮演重要角色，其中Cpn0147與Cpn0308為已發(fā)現(xiàn)的衣原體包涵體膜蛋白，但其對衣原體生長發(fā)育的影響及與宿主細(xì)胞的相互

2、作用機(jī)制尚不清楚。為此本研究構(gòu)建了HeLa細(xì)胞的酵母GAL4 AD融合的cDNA文庫，應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù)尋找Cpn0147，Cpn0308的配體蛋白，為進(jìn)一步探討Cpn0147，Cpn0308的特性和可能的生物學(xué)作用提供了前瞻性研究。
　　首先，采用Trizol法從HeLa提取總的RNA，應(yīng)用SMARTTM技術(shù)，以CDSⅢ、SMARTⅢ為引物，同時加入MMLV反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA第一鏈，在經(jīng)LD-PCR合成雙鏈cDNA后用CHRO

3、MA SPINTM+TE-400柱純化雙鏈cDNA，去除200bp以下的片段;將制備好的ds cDNA與pGADT7-Rec、Herring Tests Carrier DNA(已變性)轉(zhuǎn)化到酵母Y187感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行同源重組，在SD/-Leu/Amp+平板上培養(yǎng)4d后，用冷凍培養(yǎng)基收集菌體，做菌落PCR檢測文庫多態(tài)性;經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，PCR產(chǎn)物大小在0.3～3kb之間，顯示文庫具有良好的多態(tài)性。
　　然后從Cpn菌株

4、AR39基因組中PCR擴(kuò)增特異性片段Cpn0147，Cpn0308，經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切后克隆到誘餌載體pGBKT7中;經(jīng)菌落PCR、EcoRⅠ/BamHⅠ雙酶切初步驗證后，以pGBKT7載體上的T7引物作為測序引物進(jìn)行堿基序列測定，測序結(jié)果經(jīng)BLAST分析證實(shí)為Cpn0147，Cpn0308，將構(gòu)建成功的誘餌質(zhì)粒同時轉(zhuǎn)化酵母菌株AH109和Y187，經(jīng)檢測無自激活和細(xì)胞毒性作用。
　　最后分別將誘餌基因pG

5、BKT7-Cpn0147，pGBKT7-Cpn0308與HeLa細(xì)胞酵母GAL4 AD融合cDNA文庫進(jìn)行酵母雙雜交;用β-半乳糖苷酶印膜法、質(zhì)粒PCR進(jìn)行篩選，并通過回交實(shí)驗進(jìn)行驗證;對陽性質(zhì)粒進(jìn)行堿基序列測定，經(jīng)BLASK比對檢測其同源蛋白，確定篩選基因。結(jié)果顯示，Cpn0147、Cpn0308與HeLa細(xì)胞cDNA文庫中多個基因的編碼產(chǎn)物發(fā)生了相互作用，其中Cpn0147雜交結(jié)果包括脂肪酰輔酶A結(jié)合蛋白(ACBD3)、環(huán)腺苷酸應(yīng)答