甜椒根際合成抗生素假單胞菌遺傳多樣性分析及GP72菌株生防機(jī)制研究.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)室的已有研究表明植物根際合成吩嗪類(lèi)以及聚酮類(lèi)抗生素的假單胞菌對(duì)植物病原菌起著天然的生防作用.本課題通過(guò)在華東地區(qū)六個(gè)不同的地點(diǎn)采集甜椒根際土壤樣品,以假單胞菌株 M18 中吩嗪-1-羧酸(Phenazine-1-carboxylicacid,PCA)和藤黃綠菌素(Pyoluteorin,Plt)合成基因簇中保守基因?yàn)榉肿犹结?運(yùn)用原位雜交及檢測(cè)發(fā)酵產(chǎn)物的方法,從土壤樣品中篩選出48株能夠合成PCA與Plt 的假單胞菌群,大致占了通

2、過(guò)King's B(KMB)培養(yǎng)基篩選菌株總數(shù)的0.4﹪.其中合成PCA的菌群(45個(gè))占到了分離菌株總數(shù)的94﹪,分布的地點(diǎn)也相當(dāng)廣泛,而同時(shí)合成PCA及Pit的菌群(3個(gè))只占總數(shù)的4﹪,分布范圍也相對(duì)比較狹窄,在上述采樣點(diǎn)中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)單獨(dú)合成Plt的菌株存在.利用限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性的分析(Restriction Fragment Length Polymorphism,PCR-RFLP)方法,根據(jù)該菌群核糖體16S rDNA以及1

3、6S rDNA與23S rDNA之間的間隔區(qū)域(Inter Transcript Space,ITS)的HaeⅢ酶切片段類(lèi)型,可將所獲得的假單胞菌群分為19種不同的基因型,其中合成PCA的菌群可分為16個(gè)不同的基因型.從不同地點(diǎn)基因型的不同分布我們可以看出基因型A5廣泛分布于各個(gè)不同的采樣點(diǎn),同時(shí)每個(gè)采樣點(diǎn)都有彼此不相同的特異基因型分布.從顧莊和馬橋兩地分離得到的合成PCA的菌株分別占了PCA合成菌株總數(shù)的31.1﹪和26.7﹪.在6個(gè)

4、采樣點(diǎn)中顧莊和馬橋兩地的甜椒受真菌感染程度最輕,這也從側(cè)面暗示了合成PCA的菌株作為潛在生防菌群起到了一定的生防作用.而且在真菌病害發(fā)生較少的顧莊與馬橋兩地發(fā)現(xiàn)了更多的隸屬于基因型A5的菌株,這也在一定程度上驗(yàn)證了基因型A5在PCA合成菌群中的主導(dǎo)地位以及作為今后進(jìn)一步篩選分離潛在生防菌株的分子遺傳標(biāo)記.隨機(jī)選取每種基因型中的一個(gè)菌株為代表,通過(guò)對(duì)該區(qū)段進(jìn)行擴(kuò)增、測(cè)序以及NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的已有序列比對(duì),我們發(fā)現(xiàn)PCA.產(chǎn)生菌群中占主導(dǎo)地

5、位的菌群主要為熒光假單胞菌 (Pseudomonas,fluorescence),惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)和嗜麥芽糖假單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia).而同時(shí)合成PCA與Plt的菌株主要為熒光假單胞菌與惡臭假單胞菌.除了基因型.A2中的GP36外,那些與熒光假單胞菌和嗜麥芽糖假單胞菌表現(xiàn)出更大相似性的菌株相互之間的相似度在94﹪-99﹪之間,而那些與惡臭假單胞菌遺傳背景更接近的

6、菌株彼此之間的相似度要高一些,基本都在97﹪-99﹪之間.本研究不僅分析了此特殊菌群的遺傳多樣性,同時(shí)也為今后篩選新的生防菌株及監(jiān)測(cè)田間菌群結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)變化提供了一種分子遺傳標(biāo)記. 在菌群生態(tài)學(xué)研究的基礎(chǔ)上,從潛在的生防菌群(基因型A5)中篩選并鑒定了一株新的具有廣譜抑菌作用的潛在生防菌株.通過(guò)詳細(xì)的生理生化指標(biāo)以及遺傳背景的分析,將此潛在生防菌株命名為綠針假單胞菌GP72(Pseudomonaschlororaphis GP72)

7、.對(duì)其廣譜抗菌活性的機(jī)制研究表明:該菌株不但能夠分泌促進(jìn)植物生長(zhǎng)的一些物質(zhì),例如吲哚-3-乙酸(Indoleacetic Acid, IAA),磷酸酶和蛋白酶,同時(shí)還能產(chǎn)生鐵載體來(lái)與真菌競(jìng)爭(zhēng)相應(yīng)的生態(tài)位,更好的定殖于植物根際.通過(guò)對(duì)其次生代謝物中的抗菌活性物質(zhì)的分離純化鑒定,發(fā)現(xiàn)起主要拮抗作用的兩種吩嗪類(lèi)抗生素分別為吩嗪-卜羧酸(PCA)與2-羥基-吩嗪(2-hydroxyphenazine,2-OH-PHZ).同時(shí)還對(duì)不同培養(yǎng)基中該菌

8、株的生長(zhǎng)以及抗生素發(fā)酵過(guò)程的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行了跟蹤,并將該菌株與典型的生防菌株綠針假單胞菌30-84(P. chlororaphis 30-84)進(jìn)行了形態(tài)學(xué)、生理生化、次生代謝產(chǎn)物以及信號(hào)分子的產(chǎn)生規(guī)律的比較,結(jié)果充分表明了該菌株是一株新的潛在生防菌株.甜椒活體的生防實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,相比目前廣泛使用的化學(xué)農(nóng)藥甲霜靈(25μgml<'-1>),該菌株在一定的起始接種濃度(10<'7>CFU)下對(duì)接種辣椒疫霉的甜椒果實(shí)的具有更強(qiáng)的生防作用,對(duì)該

9、菌株生防機(jī)制的研究以及甜椒活體的生防試驗(yàn)為田間進(jìn)行更深入的生防應(yīng)用提供良好的基礎(chǔ). 為了克服采用高壓液相法(High Performance Liquid Chromatography,.HPLC)分析次生代謝物過(guò)程中存在繁瑣的樣品處理程序、流動(dòng)相的大量消耗、較長(zhǎng)的分離時(shí)間以及有機(jī)相的污染問(wèn)題,本研究試圖運(yùn)用毛細(xì)管區(qū)帶電泳(Capillary Zone Electrophoresis,CZE)建立一種快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的定量分析綠

10、針假單胞菌GP72發(fā)酵過(guò)程中兩種主要抗生素PCA及2-OH-PHZ的方法.為了減少實(shí)驗(yàn)的操作誤差,引入了吩嗪(Phenazine,PHZ)作為內(nèi)標(biāo).通過(guò)對(duì)上樣時(shí)間及方式、分離電壓、緩沖液pH值和濃度一系列條件的優(yōu)化,確定了分離這兩種吩嗪類(lèi)抗生素的最佳條件:毛細(xì)管全長(zhǎng)為49cm,內(nèi)徑為75μm,外徑為375μm,有效長(zhǎng)度為40cm.;10mM,pH7.3磷酸緩沖液:13mbar,10s壓力上樣;毛細(xì)管兩端電壓為25kv;室溫控制在25℃.

11、隨后驗(yàn)證了該方法的特異性、線性相關(guān)性、準(zhǔn)確度、精確度、靈敏度以及最小檢出限和最小定量限.結(jié)果表明2-OH-PHZ與PCA的線性相關(guān)系數(shù)分別為0.9997(n=7)與0.9993(n=7).兩者的遷移時(shí)間一直維持在1.62s與1.96s左右.濃度在250μg ml<'-1>-10μg ml<'-1>之間時(shí)兩者回收率分別保持在92.56﹪-98.77﹪與91.75﹪-98.35﹪之間,同時(shí)兩者的最低檢出限分別為0.47μg ml<'-1>與

12、0.38μg ml<'-1>,而最低定量限分別為1.56μgml<'-1>與1.28μg ml<'-1>.最后成功地運(yùn)用該方法對(duì)菌株GP72在不同培養(yǎng)基中發(fā)酵時(shí)的吩嗪類(lèi)抗生素合成代謝進(jìn)行了跟蹤監(jiān)測(cè). 最后研究了RpoN對(duì)菌株GP72發(fā)酵過(guò)程中PCA合成代謝以及該菌運(yùn)動(dòng)性的影響.通過(guò)假單胞菌中rpoN基因同源保守區(qū)段的序列比對(duì)以及生物信息學(xué)預(yù)測(cè),設(shè)計(jì)引物從菌株GP72基因組中擴(kuò)增出完整包含啟動(dòng)子區(qū)域的rpoN基因.對(duì)rpoN基因進(jìn)

13、行體外突變,雙親雜交以及同源重組,得到了rpoN基因的突變株GP72N.研究表明突變菌株GP72N的生長(zhǎng)在不同碳氮源的環(huán)境中受到了不同的抑制,泳動(dòng)性以及從動(dòng)性均大大降低,同時(shí)吩嗪類(lèi)抗生素的合成代謝水平也在一定程度上下降了.rpoN基因的互補(bǔ)菌株的各種表形均能恢復(fù)到野生型水平,rpoN基因在野生型菌株中進(jìn)行過(guò)表達(dá)并不能顯著地增強(qiáng)該菌株的運(yùn)動(dòng)性以及吩嗪合成代謝.由此我們可以得出這樣一個(gè)結(jié)論:在綠針假單胞菌中RpoN對(duì)于菌株的運(yùn)動(dòng)性以及PCA