外排泵MexAB-OprM在銅綠假單胞菌對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥機(jī)制的研究.pdf

1、第一部分碳青霉烯類耐藥銅綠假單胞菌外排泵MexAB-OprM高表達(dá)的研究
　　目的：外排泵系統(tǒng)是多重耐藥銅綠假單胞菌的重要耐藥機(jī)制之一。MexAB-OprM外排泵是銅綠假單胞菌中對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥最主要的外排泵系統(tǒng)，mexR、nalC和nalD是MexAB-OprM外排泵的調(diào)控基因。本研究是為了解MexAB-OprM外排泵在碳青霉烯類抗生素耐藥銅綠假單胞菌（carbapenem?resistant Pseudomonas ae

2、ruginosa，CRPA）中的表達(dá)情況，以及調(diào)控基因mexR, nalC和nalD的突變對(duì)外排泵基因mexA表達(dá)量的影響。
　　方法：篩選收集安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2011年～2012年微生物室分離的碳青霉烯類抗生素耐藥的銅綠假單胞菌。采用微量肉湯稀釋法檢測(cè)篩選出的銅綠假單胞菌耐藥株對(duì)亞胺培南和美羅培南的MIC（Minimal inhibitory concentration，最低抑菌濃度），并進(jìn)行外排泵表型篩選試驗(yàn)。Carb

3、a NP試驗(yàn)和EDTA協(xié)同試驗(yàn)分別用來檢測(cè)外排泵篩選陽性菌株是否產(chǎn)碳青霉烯酶和金屬酶。采用Real-time PCR檢測(cè)外排泵表型陽性的CRPA外排泵融合基因mexA的mRNA表達(dá)水平。同時(shí)利用普通PCR擴(kuò)增外排泵陽性菌株的外排泵基因mexB和調(diào)控基因mexR, nalC, nalD以及外膜蛋白OprD2基因，所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序并比對(duì)。
　　結(jié)果：75株CRPA菌株，有13株（17.3%）外排泵表型篩選試驗(yàn)陽性。這13株CRP

4、A菌株的Carba NP試驗(yàn)和EDTA協(xié)同試驗(yàn)的結(jié)果均為陰性。PCR結(jié)果顯示，13株外排泵表型陽性的銅綠假單胞菌中，有10株mexB基因陽性，且其外排泵調(diào)控基因mexR, nalC, nalD均為陽性。PCR產(chǎn)物測(cè)序比對(duì)結(jié)果顯示，有9株CRPA的NalC發(fā)生第71位氨基酸的點(diǎn)突變Gly→ Glu，其中8株CRPA同時(shí)還發(fā)生第209為氨基酸的點(diǎn)突變Ser→ Arg；僅有1株CRPA發(fā)生NalD第158位氨基酸突變Thr→Ile。有8株CR

5、PA發(fā)生MexR的點(diǎn)突變。
　　結(jié)論:MexAB-OprM外排泵在碳青霉烯類抗生素耐藥銅綠假單胞菌起著至關(guān)重要的作用。外排泵調(diào)控基因的點(diǎn)突變或許是導(dǎo)致外排泵MexAB-OprM高表達(dá)的原因之一。
　　第二部分 MexAB-OprM系統(tǒng)在銅綠假單胞菌亞胺培南耐藥的作用研究
　　目的：銅綠假單胞菌是臨床上重要的條件致病菌，由于其對(duì)碳青霉烯類抗生素的耐藥性越來越高，因此對(duì)其耐藥機(jī)制的研究越來越受到重視。MexAB-OprM是

6、銅綠假單胞菌對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥最主要的外排泵系統(tǒng)，特別是其對(duì)美羅培南耐藥十分相關(guān)，但一直認(rèn)為其對(duì)亞胺培南的耐藥無作用。本研究針對(duì)一株外排泵抑制劑對(duì)亞胺培南有效而對(duì)美羅培南無效的銅綠假單胞菌，利用同源重組技術(shù)敲除外排泵MexAB-OprM的融合蛋白基因mexA，以研究外排泵MexAB-OprM對(duì)亞胺培南耐藥的作用。
　　方法：利用細(xì)菌體內(nèi)廣泛存在RecBCD系統(tǒng)對(duì)外源進(jìn)入的DNA進(jìn)行同源重組，從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因的等位替換。首先采用

7、PCR擴(kuò)增得到mexA基因的上、下游同源臂A、B片段，再用交疊PCR擴(kuò)增得到mexA基因上下游同源臂的融合AB片段，此AB片段中間已缺失目標(biāo)基因mexA。自殺載體pLP12為T線性化載體，可直接與純化PCR產(chǎn)物連接，將目標(biāo)基因的融合AB片段與自殺載體pLP12T連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5αλpir感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)pLP-UF/pLP-UR篩選AB插入的克隆，挑取陽性克隆，提取質(zhì)粒pLP12-mexA，轉(zhuǎn)化大腸桿菌β2163。大腸桿菌

8、β2163具有高效的接合效應(yīng)，且其由于缺陷型，只能在含DAP（Diaminopimelic acid）的培養(yǎng)基中生長。將自殺載體連接產(chǎn)物pLP12-mexA通過接合輸入到靶細(xì)菌中，培養(yǎng)后菌液涂布LB平板（Cm=200μg/ml）。由于自殺載體不能在細(xì)菌中復(fù)制，在抗生素選擇（Cm）壓力下，只有整合有自殺載體的插入突變株才可以存活（發(fā)生第一次同源重組）。挑取陽性克隆，涂布含L-阿拉伯糖的LB平板上，L-阿拉伯糖能誘導(dǎo)自殺載體毒性基因的表達(dá)，

9、在第二輪反向選擇壓力下，只有細(xì)菌基因組發(fā)生第二次同源重組并丟失自殺質(zhì)粒的細(xì)菌才可以存活。第二組同源重組后，子代細(xì)菌產(chǎn)生靶基因的缺失突變株和野生型菌株，通過PCR克隆篩選后將PCR產(chǎn)物直接測(cè)序，確認(rèn)mexA缺失突變株的構(gòu)建成功。將mexA基因敲除后的菌株進(jìn)行Real-time PCR驗(yàn)證mexA的相對(duì)表達(dá)量，以及進(jìn)行亞胺培南的藥敏試驗(yàn)。
　　結(jié)果：分別以mexA上下游同源臂的引物PCR擴(kuò)增得到上下游同源臂A、B片段，其片段長度分別為

10、618bp、416bp。以A、B片段為模板，進(jìn)行交疊PCR得到AB融合片段，長度為993bp。將AB融合片段與自殺載體pLP12T連接，用載體的引物進(jìn)行 PCR驗(yàn)證，篩選得到 AB插入的克?。╬LP12-mexA），連接成功的載體片段的長度明顯長于未連接成功的載體。將連接成功的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到供體菌大腸桿菌β2163，在其高接合效率下成功將質(zhì)粒（pLP12-mexA）輸入到原始的銅綠假單胞菌（野生型）中去。同時(shí)，由于細(xì)菌胞內(nèi)重組酶的存在，接合

11、的同時(shí)也在發(fā)生基因相似片段的同源重組。在抗生素選擇（Cm）壓力下，只有質(zhì)粒插入到染色體指定位點(diǎn)的銅綠假單胞菌能存活，挑取陽性克隆并進(jìn)行PCR驗(yàn)證，野生株只產(chǎn)生一個(gè)擴(kuò)增片段，插入突變形成兩個(gè)擴(kuò)增條帶。插入突變株進(jìn)一步涂布于含 L-阿拉伯糖的 LB培養(yǎng)基上，由于 L-阿拉伯糖能誘導(dǎo)反向選擇標(biāo)記基因的毒性作用，在第二輪反向選擇壓力下，只有細(xì)菌基因組發(fā)生第二次同源重組并丟失自殺質(zhì)粒的細(xì)菌才可以存活，子代細(xì)菌產(chǎn)生靶基因的缺失突變株和野生型菌株。通

12、過PCR篩選，缺失突變克隆擴(kuò)增片段產(chǎn)生1403bp片段，野生型擴(kuò)增片段長2159bp。將缺失突變克隆菌株純化培養(yǎng)后再次擴(kuò)增驗(yàn)證，PCR產(chǎn)物測(cè)序，確認(rèn)mexA缺失突變株構(gòu)建成功。mexA基因敲除后mexA相對(duì)表達(dá)量幾乎下降至0（22.63→0.00014），該結(jié)果進(jìn)一步證明了mexA基因被敲除。對(duì)mexA基因敲除前后菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，其敲除后銅綠假單胞菌對(duì)亞胺培南的MIC明顯下降（32μg/ml→4μg/ml）。
　　結(jié)論：利用同源

13、重組的技術(shù)原理，采用線性化自殺載體pLP12T成功的將銅綠假單胞菌外排泵MexAB-OprM的mexA基因敲除。敲除后菌株對(duì)亞胺培南的耐藥性明顯下降，提示外排泵MexAB-OprM參與了亞胺培南耐藥性的形成。
　　第三部分利用RNA-seq研究銅綠假單胞菌對(duì)亞胺培南的耐藥機(jī)制
　　目的：銅綠假單胞菌對(duì)亞胺培南和美羅培南的耐藥機(jī)制不盡相同。為了更全面的了解銅綠假單胞菌對(duì)亞胺培南的耐藥機(jī)制，從而進(jìn)行本部分研究。
　　方法：

14、利用RNA-seq技術(shù)對(duì)AB菌株進(jìn)行高通量測(cè)序，分析比較二者的差異基因，來研究和探討銅綠假單胞菌對(duì)亞胺培南的耐藥機(jī)制。
　　結(jié)果：A,B菌株各做三個(gè)重復(fù)樣本，進(jìn)行細(xì)菌總RNA的提取，其RNA的質(zhì)檢結(jié)果均合格。對(duì)RNA-seq測(cè)序數(shù)據(jù)的結(jié)果進(jìn)行一系列的檢測(cè)和評(píng)估，說明測(cè)序質(zhì)量較好，可以進(jìn)行數(shù)據(jù)的比對(duì)分析。差異基因的篩選結(jié)果中，銅綠假單胞菌 IPMS株（sample A）與IPMR（sample B）相比，共有差異表達(dá)的基因630個(gè)，

15、其中297個(gè)基因明顯上調(diào)，333個(gè)基因明顯下調(diào)。其中與耐藥基因相關(guān)的差異基因共有29個(gè)，其中15個(gè)基因明顯上調(diào)，14個(gè)基因明顯下調(diào)。差異基因GO富集，共有162條GO功能注釋，其中顯著富集（P<0.05）的結(jié)果共7條，差異基因經(jīng)過KEGG富集分析，共得到83條信號(hào)通路的功能注釋，有4條通過KEGG顯著富集，其中耐藥相關(guān)通路中包括有9個(gè)基因。
　　結(jié)論：通過RNA-seq測(cè)序結(jié)果中差異基因的研究，銅綠假單胞菌對(duì)亞胺培南耐藥的主要機(jī)制