耐碳青霉烯類抗生素銅綠假單胞菌MexAB-OprM和OprD2的表達(dá)水平研究.pdf

1、一、課題背景: 銅綠假單胞菌(pseudomonas aeruginosa，PA)屬于革蘭陰性桿菌假單胞菌屬，廣泛分布于自然界，是臨床常見的條件致病菌，其感染在各種惡性腫瘤、免疫功能低下患者尤其嚴(yán)重．近年來，由于其高分離率、高耐藥率、高病死率及在臨床上時有爆發(fā)流行而引起廣泛關(guān)注．PA的耐藥性分為固有性和獲得性耐藥，且其耐藥性日益嚴(yán)重，而臨床可用于治療PA感染的抗菌藥物卻極為有限．碳青霉烯類抗生素是一類高效廣譜的β內(nèi)酰胺類抗生素，

2、對革蘭陽性菌、革蘭陰性菌、需氧菌、厭氧菌均有較強的抗菌活性，其最低抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)非常接近，且對革蘭陰性菌有一定的抗生素后效應(yīng)(PAE)，對大多數(shù)β—內(nèi)酰胺酶包括超廣譜β—內(nèi)酰胺酶(ESBLs)穩(wěn)定，與第3代頭孢菌素?zé)o交叉耐藥性，故在臨床上成為治療多重耐藥PA感染的重要抗菌藥物．然而近幾年，隨著碳青霉烯類抗生素的廣泛應(yīng)用，PA耐藥菌株急劇增加，2005年中國臨床分離PA對美羅培南和亞胺培南的耐藥率已分別達(dá)到32

3、.1％和31.3％，給臨床抗感染治療帶來了極大困難．研究PA對碳青霉烯類抗生素的耐藥機制，有助于新藥的研制，可以幫助臨床醫(yī)師制定合理的給藥方案，提高PA感染的療效，防止耐藥菌株的產(chǎn)生和播散． 已知藥物外排泵在許多細(xì)菌中存在，分為ATP水解能驅(qū)動型外排泵和跨膜質(zhì)子梯度能驅(qū)動型外排泵，后者包括主要易化超家族(MFS)、多藥和毒性化合物外排家族(MATE)、小多藥耐藥家族(SMR)和耐藥小結(jié)節(jié)細(xì)胞分裂家族(RND)．其中RND型外排泵

4、在革蘭陰性菌包括PA的耐藥中發(fā)揮著越來越重要的作用．已證實的PARND型外排泵有：MexAB-OprM、MexCD—OprJ、MexEF—OprN、MexXY—OprM、MexJK—OprM和MexGHI—OpmD，它們均為三組分結(jié)構(gòu)，包括內(nèi)膜轉(zhuǎn)運蛋白(MexB，D，F(xiàn)，Y，K，I)、內(nèi)膜相關(guān)質(zhì)膜融合蛋白(MexA，C，E，X，J，H)和外排通道蛋白(OprM，J，N，OpmD)．其中MexAB-OprM和MexXY—OprM在PA的固

5、有性耐藥中起著重要的作用，MexXY—OprM主要介導(dǎo)PA對氨基糖苷類抗生素的固有性耐藥，目前研究認(rèn)為美羅培南不經(jīng)特殊通道擴散，PA對美羅培南耐藥的主要原因是MexAB-OprM外排泵的過度表達(dá)，它能夠?qū)⒁呀?jīng)進入菌體的美羅培南轉(zhuǎn)運出菌體胞質(zhì)，從而使得藥物在菌體胞質(zhì)的累積率下降，而造成對美羅培南的耐藥，甚至是高度耐藥． PA外膜上有多種外膜蛋白，可形成小孔通道，抗菌藥物經(jīng)這些外膜通道進入細(xì)菌，如果這些通道改變或缺失，抗菌藥物將不能

6、進入細(xì)菌到達(dá)作用靶位．外膜蛋白OprD2孔道是小分子亞胺培南選擇性快速進入菌體的特異性通道，且國外已有研究證明PA對亞胺培南的耐藥與青霉素結(jié)合蛋白的改變基本無關(guān)．OprD2是目前所知的PA外膜中唯一有助于抗生素通透的孔道蛋白，能形成亞胺培南的特異性結(jié)合位點，當(dāng)OprD2減少或丟失時可導(dǎo)致PA對亞胺培南耐藥．所以目前認(rèn)為外膜蛋白OprD2的丟失或含量減少是PA對亞胺培南耐藥的主要機制之一． 綜上所述，攜帶外膜通道蛋白OprD2基因

7、缺失或多藥外排泵的過表達(dá)是導(dǎo)致PA對碳青霉烯類抗生素耐藥的重要原因，特別是外排泵的發(fā)現(xiàn)從根本上改變了對PA多重耐藥機制的認(rèn)識，也使我們意識到泵介導(dǎo)多重耐藥的重要性．因此收集了我國臨床分離的655株P(guān)A，并研究了其對亞胺培南和美羅培南的耐藥性及外排泵抑制劑(efflux pump inhibitor，EPI)CCCP對其耐藥性的影響，采用實時熒光定量PCR方法(Real—timeRT—qPCR)研究我國臨床分離的PA菌株對碳青霉烯類抗生素

8、的耐藥性與MexAB-OprM和OprD2的相關(guān)性． 二、材料與方法: 收集我國臨床分離的PA655株，瓊脂稀釋法測定PA加入外排泵抑制劑前后對亞胺培南和美羅培南的MIC；Real—timeRT—qPCR檢測外排泵MexAB-OprM和孔蛋白OprD2的表達(dá)水平；SDS-PAGE和Western—blot檢測外膜孔蛋白OprD2．結(jié)果采用x2檢驗法和方差分析法統(tǒng)計． 三、結(jié)果: 收集到的655株P(guān)A菌株對

9、亞胺培南和美羅培南的不敏感率分別為47.48％和40.76％，加入外排泵抑制劑前后并無明顯變化；52.04％(51/98)美羅培南耐藥株MexAB-OprM顯著高表達(dá)，明顯高于敏感菌株(P＜0.05)，43.70％(59/135)亞胺培南耐藥株OprD2顯著低表達(dá)，14.81％(20/135)亞胺培南耐藥株OprD2表達(dá)缺失，明顯低于敏感菌株(P＜0.05)；SDS-PAGE和Western—blot顯示與標(biāo)準(zhǔn)菌株P(guān)AO1相比，OprD