基于Microarray芯片技術(shù)篩選大鼠腦創(chuàng)傷后皮層差異表達(dá)的microRNA.pdf

1、目的： 利用microRNA芯片檢測大鼠液壓顱腦創(chuàng)傷后大腦皮層差異表達(dá)的microRNA，為顱腦創(chuàng)傷治療中的microRNA干預(yù)策略提供可供選擇的目標(biāo)microRNA。 方法： 選取顱腦創(chuàng)傷后6h、24h、48h及72h等4個(gè)時(shí)間點(diǎn)，隨機(jī)挑選每個(gè)時(shí)間點(diǎn)2只大鼠，再選2只正常對(duì)照大鼠，共成年Wistar大鼠10只。4組實(shí)驗(yàn)組均經(jīng)過液壓顱腦損傷儀的致傷過程，實(shí)驗(yàn)組大鼠及對(duì)照組大鼠分別處死后迅速取腦，分離皮層組織，-8

2、0℃低溫保存。使用Trizol試劑提取皮層組織總RaNA，玻片點(diǎn)樣，芯片雜交，單通道激光共聚焦顯微鏡掃描，所得原始數(shù)據(jù)經(jīng)Log轉(zhuǎn)換，SAM（Significance Analysis of Microarrays）統(tǒng)計(jì)分析，分層聚類Cluster，尋找可能的差異表達(dá)的microRNAs。經(jīng)權(quán)威靶基因預(yù)測網(wǎng)站PicTar檢索，得出差異表達(dá)microRNA的預(yù)測靶基因。 結(jié)果： 經(jīng)SAM統(tǒng)計(jì)軟件分析，創(chuàng)傷后6小時(shí)組共有136

3、個(gè)microRNA表達(dá)，其中，2倍以上差異表達(dá)上調(diào)的13個(gè)，2倍以上差異表達(dá)下調(diào)的14個(gè)；創(chuàng)傷后24小時(shí)組共有118個(gè)microRNA表達(dá)，其中，2倍以上差異表達(dá)上調(diào)的4個(gè)，2倍以上差異表達(dá)下調(diào)的23個(gè)；創(chuàng)傷后48小時(shí)組共有149個(gè)microRNA表達(dá)，其中，2倍以上差異表達(dá)上調(diào)的16個(gè)，2倍以上差異表達(dá)下調(diào)的11個(gè)；創(chuàng)傷后72小時(shí)組共有203個(gè)microRNA表達(dá)，其中，2倍以上差異表達(dá)上調(diào)的19個(gè)，2倍以上差異表達(dá)下調(diào)的5個(gè)。其中，

4、僅有miR-21在4個(gè)傷后時(shí)間點(diǎn)上均高表達(dá)，差異表達(dá)比值分別為2．0215、2．0401、2．0702、2．7910。通過在線Pictar預(yù)測工具的分析，目前得出miR-21的可能靶基因有175個(gè)。其中包括與凋亡過程密切相關(guān)的BCL2、CAPN3、PDCD4、TIMP3、PPP3CA及FASLG等基因。這些靶基因參與的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路包括：PPP3CA參與長時(shí)程增強(qiáng)，F(xiàn)ASLG、PPP3CA、RASA1、NTF3、RASGRP1參與絲裂原活

5、化蛋白激酶MAPK信號(hào)通路，PPP3CA參與Wnt信號(hào)通路，JAG1參與Notch信號(hào)通路，PPP3CA參與血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子VEGF信號(hào)通路，CNTFR、STAT3、SPRY1、SPRY2參與JAK-STATs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，PITX2、ACVR2A、SMAD7參與轉(zhuǎn)化生長因子FGF-β信號(hào)通路等。 結(jié)論： 1．microRNA微陣列技術(shù)可以用于高通量的篩選miRNA。 2．通過microarray芯片分析，得

6、出大鼠顱腦創(chuàng)傷后大腦皮層差異microRNA表達(dá)譜，其中，僅發(fā)現(xiàn)miR-21在傷后4個(gè)時(shí)間點(diǎn)（6h，24h，48h，72h）上均呈2倍以上增高。推測miR-21可能在腦創(chuàng)傷病理過程中扮演了某些重要角色。 3．經(jīng)在權(quán)威的miRNA預(yù)測網(wǎng)站PicTar上檢索，目前發(fā)現(xiàn)miR-21的靶基因有175個(gè)。其中包括與凋亡過程密切相關(guān)的BCL2、CAPN3、PDCD4、TIMP3、PPP3CA及FASLG等基因。 4．通過分子生物功能

7、注釋系統(tǒng)MAS（molecular annotation system）分析，初步了解了miR-21靶基因及其相應(yīng)編碼蛋白之間的相互作用關(guān)系，及其在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、長時(shí)程增強(qiáng)和細(xì)胞凋亡等一些與顱腦損傷過程密切相關(guān)的重要生理功能方面的作用，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究詳細(xì)分析腦外傷后機(jī)體內(nèi)的分子作用機(jī)制奠定一定的基礎(chǔ)。 5．包括miR-21在內(nèi)的許多miRNAs的功能和作用機(jī)制尚不十分清楚，因而對(duì)miRNAs的實(shí)際應(yīng)用目前尚未開展。miRN