人椎間盤退變差異性表達(dá)microRNA的篩選及驗(yàn)證研究.pdf

1、目的：
　　檢測人腰椎間盤髓核細(xì)胞microRNA(miRNA)表達(dá)譜，篩選退變髓核細(xì)胞與正常髓核細(xì)胞差異性表達(dá)的miRNA，預(yù)測差異性表達(dá)miRNA的靶基因及信號通路；對顯著性差異表達(dá)的miR-494和miR-513a-5p在人退變腰椎間盤組織中進(jìn)行驗(yàn)證。為miRNA在人椎間盤退變發(fā)病機(jī)制中作用的研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.分別獲取腰椎退行性病患者手術(shù)取出的髓核組織3份和腰椎骨折患者髓核組織1份，分為退變

2、組和正常組。采用酶消化法從髓核組織中分離出髓核細(xì)胞，后放置培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。第一代細(xì)胞爬片至70％～80％融合時(shí)，將細(xì)胞爬片取出，對髓核細(xì)胞進(jìn)行染色鑒定；提取標(biāo)本總RNA，采用miRNA微陣列技術(shù)檢測兩組細(xì)胞中miRNA表達(dá)譜，篩選出差異表達(dá)的miRNAs；采用MicroCosmv5、TargetScan5.1和MICRORNA-ORG軟件預(yù)測差異性miRNAs的靶基因；將差異基因或靶基因進(jìn)行Gene Ontology(GO)分析；統(tǒng)計(jì)每個(gè)

3、GO term中所包括的差異基因或靶基因個(gè)數(shù)，并用Fisher精確檢驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)方法計(jì)算每個(gè)GO term中差異基因或靶基因富集的顯著性：后將得到的差異基因或靶基因進(jìn)行Pathway顯著性分析，分析每個(gè)Pathway中所包含的差異基因或靶基因個(gè)數(shù)，用超幾何分布的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)方法計(jì)算出反映Pathway中差異基因或靶基因分布富集顯著性的Pvalue，根據(jù)Pvalue大小找出與差異基因或靶基因功能顯著相關(guān)的生物通路。
　　2.分別獲取腰椎退行

4、性病患者手術(shù)取出的髓核組織5份和腰椎骨折患者髓核組織2份，分為退變組和正常組。手術(shù)取出標(biāo)本后即刻保存于RNA保存液中，4℃保存過夜，取出后將髓核組織進(jìn)行分離。首先將每個(gè)標(biāo)本的一部分做病理切片、染色驗(yàn)證其退變性；然后另一部分標(biāo)本采用Real-time qPCR技術(shù)對miR-494和miR-513a-5p差異性表達(dá)檢測。包括RNA提取，miRNA反轉(zhuǎn)錄，實(shí)時(shí)熒光定量PCR；按照△△Ct解析法來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，采用染料法(SYBR、GreenⅠ

5、)進(jìn)行相對定量分析。
　　結(jié)果：
　　退變及正常的髓核細(xì)胞經(jīng)過酶消化法分離、培養(yǎng)后均呈典型的髓核細(xì)胞形態(tài)。通過miRNA微陣列分析發(fā)現(xiàn)退變組中呈差異性上調(diào)的miRNAs有20種(miR-21*、miR-663、miR-29c*、miR-638、miR-572、miR-1225-5p、miR-513a-5p、miR-101、miR-1275、miR-10b、miR-923、miR-195、miR-575、miR-181d、mi

6、R-494、miR-765、miR-210、miR-497、miR-483-5p、miR-345)。其中，miR-513a-5p和miR-494呈顯著性高表達(dá)，Ratio值分別為2.2222和2.9485；綜合三種軟件MicroCosm v5、TargetScan5.1和MICRORNA.ORG預(yù)測得出miR-513a-5p和miR-494的靶基因分別為MKK4和JunD，此兩種靶基因均參與JNK信號通路，且兩個(gè)靶基因在此通路中均顯著上

7、調(diào)。
　　通過對病理切片和染色證實(shí)了退變和正常髓核組織的特點(diǎn)；通過Real-timeqPCR技術(shù)檢測顯示退變組中miR-513a-5p與miR-494較正常組均呈現(xiàn)明顯的高表達(dá)，差異倍數(shù)2-△△Ct值分別為47.3660±39.0525和13.5560±7.9860(P<0.05)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，兩種miRNA高表達(dá)的差異倍數(shù)較基因芯片篩選結(jié)果更為明顯。驗(yàn)證了微陣列差異基因篩選結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性。
　　結(jié)論：

8、　　本研究首次通過miRNA微陣列技術(shù)對人腰椎間盤髓核細(xì)胞進(jìn)行了miRNA表達(dá)譜分析，篩選出退變椎間盤中差異性表達(dá)上調(diào)的miRNAs共20種，其中miR-513a-5p和miR-494呈現(xiàn)非常顯著性上調(diào)；預(yù)測出miR-513a-5p和miR-494對應(yīng)的靶基因MKK4和JunD，及其可能共同參與并發(fā)揮作用的信號傳導(dǎo)通路JNK通路；Real-time qPCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)驗(yàn)證了miR-513a-5p和miR-494在退變髓核組織中的同樣呈現(xiàn)顯