血管鈣化過程中microRNA差異性表達譜的篩選及動態(tài)變化研究.pdf

1、第一部分血管鈣化模型的鑒定
　　目的：
　　鑒定血管鈣化的動物及細胞模型，為觀察血管鈣化發(fā)生發(fā)展過程中miRNA表達譜的變化提供可靠的研究模型。
　　方法：
　　1.動物模型的鑒定：SPF級4和12周齡OPG基因敲除小鼠及野生型小鼠，摘其眼球取血樣以檢測血清中Runx2及ALP水平，處死后分離主動脈組織，10％福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，HE染色觀察主動脈鈣化情況，免疫組化觀察主動脈Runx2及ALP表達情況。<

2、br>　　2.細胞模型的鑒定：應用10 mmol/Lβ-甘油磷酸鈉（β-GP）處理小鼠血管平滑肌細胞（MOVAS）0、14、21及38天（0天為對照組），通過茜素紅染色觀察細胞鈣化情況。
　　結果：
　　1.動物模型
　　1.1 HE染色：4和12周齡野生型小鼠及4周齡OPG基因敲除（OPG-/-）小鼠的主動脈均未見鈣化現象，而12周齡OPG-/-小鼠主動脈則出現明顯的病理性鈣化。
　　1.2免疫組化：12周齡O

3、PG-/-小鼠主動脈組織中ALP及RUNX2均呈高表達，尤其是高表達與鈣化斑塊區(qū)域。
　　1.3 ELISA檢測：4和12周齡OPG-/-小鼠血清中ALP及RUNX2水平均明顯高于同周齡的野生型小鼠（P<0.05）。
　　2.細胞模型
　　小鼠血管平滑肌細胞（MOVAS）在鈣化培養(yǎng)基誘導21天時出現較為明顯的鈣化現象，38天則呈現多發(fā)性散在鈣化結節(jié)。
　　結論：
　　1．4周齡OPG-/-小鼠血清中ALP及

4、RUNX2水平明顯升高，但其主動脈未見鈣化；12周齡OPG-/-小鼠主動脈出現明顯的病理性鈣化，且同時伴有血清中及主動脈組織中ALP及RUNX2水平異常升高。
　　2.小鼠血管平滑肌細胞（MOVAS）在β-甘油磷酸鈉處理21天時可出現明顯的鈣化，成功建立了血管鈣化細胞模型。
　　第二部分血管鈣化過程中microRNA表達譜的動態(tài)變化
　　目的：
　　應用miRNA芯片技術，篩選血管鈣化過程中差異性表達的miRNA

5、及觀察血管鈣化發(fā)生發(fā)展過程中miRNA表達譜的動態(tài)變化，旨在為進一步確認調控血管鈣化的關鍵miRNA奠定基礎。
　　方法：
　　1.動物模型：病理學鑒定的4周齡OPG-/-小鼠（無主動脈鈣化）及12周齡OPG-/-小鼠（明顯主動脈鈣化）的主動脈組織，及相應周齡的野生型小鼠主動脈組織，分別提取總RNA，應用芯片技術檢測各樣本的miRNA表達譜，并對芯片數據進行比值及聚類分析等。
　　2.細胞模型：β-甘油磷酸鈉處理0天（

6、對照組）及21天（明顯鈣化組）的MOVAS細胞，分別提取總RNA，應用芯片技術檢測各樣本的miRNA表達譜，并對芯片數據進行比值及聚類分析等。
　　結果：
　　1.動物模型miRNA表達譜
　　1.14周齡動物：與野生型小鼠相比，OPG-/-小鼠主動脈組織中共有370個差異性表達（倍數改變>1.5倍）的miRNA，其中上調的有 miR-125b-5p、miR-126-3p等162個，下調的有 miR-320、miR-2

7、861等208個。其中56個有顯著差異性（P<0.05），miR-139-5p等33個表達上調，miR-18a-5p等23個表達下調。
　　1.212周齡動物：與野生型小鼠相比，OPG-/-小鼠主動脈組織中共有差異性表達的miRNA有101個，上調的有74個，下調的有27個。其中16個顯著差異性表達的miRNAs（P<0.05），高表達的有miR-425-5p、miR-125b-5p等8個，低表達的有miR-29a-5p、miR-

8、187-3p等8個。
　　2.細胞模型miRNA表達譜
　　與對照組（誘導0天）相比，誘導21天出現明顯鈣化的細胞組有92個差異性表達的miRNAs（倍數改變>1.5倍），其中 miR-30a-5p等57個表達上調，miR-29a-5p等35個表達下調。
　　結論：
　　通過芯片技術獲得了血管鈣化過程中不同階段的差異性表達的miRNA譜，首次在一定程度上揭示了miR-125b-5p等miRNA族在鈣化發(fā)生發(fā)展中的