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文檔簡介
1、第一部分血管鈣化模型的鑒定
目的:
鑒定血管鈣化的動物及細胞模型,為觀察血管鈣化發(fā)生發(fā)展過程中miRNA表達譜的變化提供可靠的研究模型。
方法:
1.動物模型的鑒定:SPF級4和12周齡OPG基因敲除小鼠及野生型小鼠,摘其眼球取血樣以檢測血清中Runx2及ALP水平,處死后分離主動脈組織,10%福爾馬林固定,常規(guī)石蠟包埋,HE染色觀察主動脈鈣化情況,免疫組化觀察主動脈Runx2及ALP表達情況。<
2、br> 2.細胞模型的鑒定:應用10 mmol/Lβ-甘油磷酸鈉(β-GP)處理小鼠血管平滑肌細胞(MOVAS)0、14、21及38天(0天為對照組),通過茜素紅染色觀察細胞鈣化情況。
結果:
1.動物模型
1.1 HE染色:4和12周齡野生型小鼠及4周齡OPG基因敲除(OPG-/-)小鼠的主動脈均未見鈣化現象,而12周齡OPG-/-小鼠主動脈則出現明顯的病理性鈣化。
1.2免疫組化:12周齡O
3、PG-/-小鼠主動脈組織中ALP及RUNX2均呈高表達,尤其是高表達與鈣化斑塊區(qū)域。
1.3 ELISA檢測:4和12周齡OPG-/-小鼠血清中ALP及RUNX2水平均明顯高于同周齡的野生型小鼠(P<0.05)。
2.細胞模型
小鼠血管平滑肌細胞(MOVAS)在鈣化培養(yǎng)基誘導21天時出現較為明顯的鈣化現象,38天則呈現多發(fā)性散在鈣化結節(jié)。
結論:
1.4周齡OPG-/-小鼠血清中ALP及
4、RUNX2水平明顯升高,但其主動脈未見鈣化;12周齡OPG-/-小鼠主動脈出現明顯的病理性鈣化,且同時伴有血清中及主動脈組織中ALP及RUNX2水平異常升高。
2.小鼠血管平滑肌細胞(MOVAS)在β-甘油磷酸鈉處理21天時可出現明顯的鈣化,成功建立了血管鈣化細胞模型。
第二部分血管鈣化過程中microRNA表達譜的動態(tài)變化
目的:
應用miRNA芯片技術,篩選血管鈣化過程中差異性表達的miRNA
5、及觀察血管鈣化發(fā)生發(fā)展過程中miRNA表達譜的動態(tài)變化,旨在為進一步確認調控血管鈣化的關鍵miRNA奠定基礎。
方法:
1.動物模型:病理學鑒定的4周齡OPG-/-小鼠(無主動脈鈣化)及12周齡OPG-/-小鼠(明顯主動脈鈣化)的主動脈組織,及相應周齡的野生型小鼠主動脈組織,分別提取總RNA,應用芯片技術檢測各樣本的miRNA表達譜,并對芯片數據進行比值及聚類分析等。
2.細胞模型:β-甘油磷酸鈉處理0天(
6、對照組)及21天(明顯鈣化組)的MOVAS細胞,分別提取總RNA,應用芯片技術檢測各樣本的miRNA表達譜,并對芯片數據進行比值及聚類分析等。
結果:
1.動物模型miRNA表達譜
1.14周齡動物:與野生型小鼠相比,OPG-/-小鼠主動脈組織中共有370個差異性表達(倍數改變>1.5倍)的miRNA,其中上調的有 miR-125b-5p、miR-126-3p等162個,下調的有 miR-320、miR-2
7、861等208個。其中56個有顯著差異性(P<0.05),miR-139-5p等33個表達上調,miR-18a-5p等23個表達下調。
1.212周齡動物:與野生型小鼠相比,OPG-/-小鼠主動脈組織中共有差異性表達的miRNA有101個,上調的有74個,下調的有27個。其中16個顯著差異性表達的miRNAs(P<0.05),高表達的有miR-425-5p、miR-125b-5p等8個,低表達的有miR-29a-5p、miR-
8、187-3p等8個。
2.細胞模型miRNA表達譜
與對照組(誘導0天)相比,誘導21天出現明顯鈣化的細胞組有92個差異性表達的miRNAs(倍數改變>1.5倍),其中 miR-30a-5p等57個表達上調,miR-29a-5p等35個表達下調。
結論:
通過芯片技術獲得了血管鈣化過程中不同階段的差異性表達的miRNA譜,首次在一定程度上揭示了miR-125b-5p等miRNA族在鈣化發(fā)生發(fā)展中的
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