基因芯片篩選GJB6突變體的差異表達基因.pdf

1、研究背景
　　有汗性外胚葉發(fā)育不良(hidrotic ectodermal dysplasia，HED)，即Clouston綜合征，是一種以甲營養(yǎng)不良、毛發(fā)缺陷和掌跖角化過度等三聯(lián)征為特征的遺傳性綜合征，屬于常染色體顯性遺傳。編碼縫隙連接蛋白30(Cx30)的GJB6基因為HED的致病基因。至今共發(fā)現(xiàn)五種錯義突變，分別為G11R、A88V、V37E、D50N和N14S。目前對HED的發(fā)病機制研究甚少，即Cx30所發(fā)揮的功能，需要我

2、們進行深入研究。隨著人類基因組計劃的逐步完成，基因表達譜芯片成為研究基因差異表達的重要工具之一，基因芯片技術具有高通量、低成本、自動化、防污染等優(yōu)勢。本課題組前期利用Tet-on基因表達系統(tǒng)成功構建了穩(wěn)定表達GJB6基因野生型及其突變型A88V的HaCaT細胞株，為后續(xù)實驗提供了穩(wěn)定的實驗模型。本課題繼續(xù)運用該技術構建GJB6基因中功能最強的G11R突變的HaCaT細胞株，并制作Affymetrix表達譜芯片，旨在發(fā)現(xiàn)并探討GJB6基因

3、可能參與的信號通路及作用機制。
　　目的
　　采用基因芯片技術篩選穩(wěn)定轉染GJB6突變基因的HaCaT細胞差異表達基因，初步探討突變基因在HaCaT細胞上可能調控的信號通路及機制。
　　方法
　　利用Tet-on基因表達系統(tǒng)構建穩(wěn)定表達GJB6基因突變型G11R的HaCaT細胞株，制作Affymetrix表達譜芯片:提取細胞總RNA，質檢合格后，進行熒光標記，芯片雜交，洗染，掃描，數(shù)據(jù)分析，篩選出差異表達基因。利

4、用IPA（Ingenuity Pathway Analysis）系統(tǒng)對芯片數(shù)據(jù)進行生物信息分析，篩選出差異表達倍數(shù)較多且與疾病功能密切相關的基因，使用WES全自動蛋白質印跡定量分析系統(tǒng)進行表達驗證。
　　結果
　　總RNA質檢結果:根據(jù)Thermo Nano Drop2000檢測的A260/A280值以及Agilent2100檢測RIN和28S/18S值，結果顯示RIN＞=9.3，28S/18S＞=1.5，A260/A280

5、在1.99到2.06之間，樣品質檢合格，進行后續(xù)實驗?；蛐酒Y果數(shù)據(jù)篩查結果:OE組（目的基因組）與NC組（對照組）比較，上調基因數(shù)為546個，下調基因數(shù)目為926個（p＜0.05且差異均在2倍以上）。生物信息分析顯示:差異基因富集多方面疾病及功能，其中細胞凋亡、細胞分化、上皮細胞分化、真皮細胞分化、表皮細胞分化、上皮組織生長、上皮組織的瘤形成等可能與GJB6基因的功能密切相關(p＜0.05，z值分別為2.224，2.756，2.96

6、8，2.882，2.562，2.423，2.798)。重點選取上皮分化通路和細胞凋亡通路的10個差異基因進行驗證。WES全自動蛋白質印跡定量分析結果:MKI67蛋白表達下調73.65％，PLK1蛋白表達下調48.41％，BCL2L11蛋白表達上調147.21％，與芯片篩選結果一致。
　　結論
　　基因芯片技術可以快速、高通量、高敏度地篩選出GJB6突變基因的差異表達基因，這些差異基因通過調節(jié)多個信號通路發(fā)揮作用，為HED發(fā)病