基因芯片篩選GJB6突變體的差異表達(dá)基因.pdf

1、研究背景
　　有汗性外胚葉發(fā)育不良(hidrotic ectodermal dysplasia，HED)，即Clouston綜合征，是一種以甲營(yíng)養(yǎng)不良、毛發(fā)缺陷和掌跖角化過(guò)度等三聯(lián)征為特征的遺傳性綜合征，屬于常染色體顯性遺傳。編碼縫隙連接蛋白30(Cx30)的GJB6基因?yàn)镠ED的致病基因。至今共發(fā)現(xiàn)五種錯(cuò)義突變，分別為G11R、A88V、V37E、D50N和N14S。目前對(duì)HED的發(fā)病機(jī)制研究甚少，即Cx30所發(fā)揮的功能，需要我

2、們進(jìn)行深入研究。隨著人類(lèi)基因組計(jì)劃的逐步完成，基因表達(dá)譜芯片成為研究基因差異表達(dá)的重要工具之一，基因芯片技術(shù)具有高通量、低成本、自動(dòng)化、防污染等優(yōu)勢(shì)。本課題組前期利用Tet-on基因表達(dá)系統(tǒng)成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)GJB6基因野生型及其突變型A88V的HaCaT細(xì)胞株，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀１菊n題繼續(xù)運(yùn)用該技術(shù)構(gòu)建GJB6基因中功能最強(qiáng)的G11R突變的HaCaT細(xì)胞株，并制作Affymetrix表達(dá)譜芯片，旨在發(fā)現(xiàn)并探討GJB6基因

3、可能參與的信號(hào)通路及作用機(jī)制。
　　目的
　　采用基因芯片技術(shù)篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染GJB6突變基因的HaCaT細(xì)胞差異表達(dá)基因，初步探討突變基因在HaCaT細(xì)胞上可能調(diào)控的信號(hào)通路及機(jī)制。
　　方法
　　利用Tet-on基因表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)GJB6基因突變型G11R的HaCaT細(xì)胞株，制作Affymetrix表達(dá)譜芯片:提取細(xì)胞總RNA，質(zhì)檢合格后，進(jìn)行熒光標(biāo)記，芯片雜交，洗染，掃描，數(shù)據(jù)分析，篩選出差異表達(dá)基因。利

4、用IPA（Ingenuity Pathway Analysis）系統(tǒng)對(duì)芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息分析，篩選出差異表達(dá)倍數(shù)較多且與疾病功能密切相關(guān)的基因，使用WES全自動(dòng)蛋白質(zhì)印跡定量分析系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)驗(yàn)證。
　　結(jié)果
　　總RNA質(zhì)檢結(jié)果:根據(jù)Thermo Nano Drop2000檢測(cè)的A260/A280值以及Agilent2100檢測(cè)RIN和28S/18S值，結(jié)果顯示RIN＞=9.3，28S/18S＞=1.5，A260/A280

5、在1.99到2.06之間，樣品質(zhì)檢合格，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)?；蛐酒Y(jié)果數(shù)據(jù)篩查結(jié)果:OE組（目的基因組）與NC組（對(duì)照組）比較，上調(diào)基因數(shù)為546個(gè)，下調(diào)基因數(shù)目為926個(gè)（p＜0.05且差異均在2倍以上）。生物信息分析顯示:差異基因富集多方面疾病及功能，其中細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分化、上皮細(xì)胞分化、真皮細(xì)胞分化、表皮細(xì)胞分化、上皮組織生長(zhǎng)、上皮組織的瘤形成等可能與GJB6基因的功能密切相關(guān)(p＜0.05，z值分別為2.224，2.756，2.96

6、8，2.882，2.562，2.423，2.798)。重點(diǎn)選取上皮分化通路和細(xì)胞凋亡通路的10個(gè)差異基因進(jìn)行驗(yàn)證。WES全自動(dòng)蛋白質(zhì)印跡定量分析結(jié)果:MKI67蛋白表達(dá)下調(diào)73.65％，PLK1蛋白表達(dá)下調(diào)48.41％，BCL2L11蛋白表達(dá)上調(diào)147.21％，與芯片篩選結(jié)果一致。
　　結(jié)論
　　基因芯片技術(shù)可以快速、高通量、高敏度地篩選出GJB6突變基因的差異表達(dá)基因，這些差異基因通過(guò)調(diào)節(jié)多個(gè)信號(hào)通路發(fā)揮作用，為HED發(fā)病